1、1,Speaker:xxx,Institution:xxx,Cancer-SpecificRetargetingofBAFComplexesbyaPrion-likeDomain,Method:,2,3,4,構(gòu)建包裝質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒包裝質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)48-72小時(shí)，收集培養(yǎng)液，離心濃縮轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞檢驗(yàn)敲除或過表達(dá)效率：mRNA水平：RT-qPCR蛋白質(zhì)水平：Westernblot,5,Genedeliveryvectorandpackagingvectorspspax2andpMD2.G:,GenedeliveryvectorandpackagingvectorsGA

2、G/POLandVSVplasmids:,Method:PEI轉(zhuǎn)染,Method:LT1轉(zhuǎn)染,6,7,8,由于本文中研究的EWSR1、FLI1、EWS-FLI1、BAF復(fù)合體等定位于細(xì)胞核，所以體外實(shí)驗(yàn)需要抽提核蛋白,9,（1）收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞IP裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）免疫沉淀，冰上或者4裂解30min,12,000g離心30min后取上清；（2）取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液將1g相應(yīng)的抗體和10-50lproteinA/G-beads加入到細(xì)胞裂解液，4C緩慢搖晃孵育過夜；（3）免疫沉淀反應(yīng)后，在4C以3,000g速度離心5min,將proteinA/G

3、-beads離心至管底；將上清小心吸去，proteinA/G-beads用1ml裂解緩沖液洗3-4次；最后加入15l的2SDS加樣緩沖液，沸水煮10分鐘；（4）SDS-PAGE,Westernblotting或進(jìn)行質(zhì)譜分析。,10,UreaDenaturationStudies,DensitySedimentationAnalyses,用于檢驗(yàn)EWSR1和EWS-FLI1是否是BAF復(fù)合體的核心成分,用于檢驗(yàn)EWSR1和EWS-FLI1是否是BAF復(fù)合體的核心成分,濃度范圍：0.25to2.5Murea；使用尿素濃度梯度處理，比較EWSR1與BAF復(fù)合體相互作用減弱的尿素濃度,11,（1）甲醛

4、交聯(lián)整個(gè)細(xì)胞系（組織），即將目標(biāo)蛋白與染色質(zhì)連結(jié)起來；（2）分離基因組DNA，并用超聲波將其打斷成一定長(zhǎng)度的小片段；（3）添加與目標(biāo)蛋白質(zhì)特異的抗體，該抗體與目標(biāo)蛋白形成免疫沉淀免疫結(jié)合復(fù)合體；（4）去交聯(lián)，純化DNA即得到染色質(zhì)免疫沉淀的DNA樣本，準(zhǔn)備測(cè)序；（5）將準(zhǔn)備好的樣本進(jìn)行深度測(cè)序。,12,13,(B),14,ChIP-seqvsATAC-seq,15,1.Biotinylatedisoxazole-MediatedPrecipitation,2.Proteinpurificationandsedimentationassays,3.Confocalimagingofimmunofluorescence,可沉淀具有低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，如EWSR1。研究融合蛋白EWSR1Z-FLI1在有生物素化異惡唑時(shí)的沉淀情況,大腸桿菌體外表達(dá)GST-EWSR1-FLI1及GST-FLI1，再研究各自的沉淀情況,比較MSCs中V5-EWS-FLI1和V5-FLI1的點(diǎn)的形狀,16,使