1、GB 4789.382012食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計(jì)數(shù),參考標(biāo)準(zhǔn),本標(biāo)準(zhǔn)采用的定義是大腸埃希氏菌，方法主要參考的是美國FDA Bacteriological Analytical Manual（2002）中的Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria。,VRBAMUG平板計(jì)數(shù)法,MUG對大腸埃希氏菌的生長繁殖沒有抑制作用也沒有促進(jìn)作用，對菌落形態(tài)也沒有影響。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在MUG濃度從0 g/mL到200 g/mL的范圍內(nèi)，大腸埃希氏菌生長繁殖率沒有區(qū)別。 MUG方法有大約4%的假陰性，特別是倍受關(guān)心的O157:H7菌

2、株為陰性，令人感到遺憾，但經(jīng)典的常規(guī)方法也同樣存在這樣的問題。,VRBAMUG平板計(jì)數(shù)法,常規(guī)方法不能檢出不產(chǎn)氣菌株和乳糖遲緩發(fā)酵菌株，而且由于O157:H7菌株不能耐受44的培養(yǎng)溫度而同樣不能檢出O157:H7菌株，普通變形桿菌等某些雜菌的存在對大腸埃希氏菌發(fā)酵乳糖的產(chǎn)氣能力具有抑制作用，但對分解MUG產(chǎn)生熒光的能力沒有抑制作用。,VRBAMUG平板計(jì)數(shù)法,研究還證實(shí)，大腸埃希氏菌熒光反應(yīng)比產(chǎn)氣反應(yīng)出現(xiàn)得更早，并且不受食品的影響，僅發(fā)現(xiàn)對牡蠣直接進(jìn)行的檢驗(yàn)不適合用MUG方法，因?yàn)槟迪牼哂袃?nèi)源性葡萄糖苷酸酶。,VRBAMUG平板計(jì)數(shù)法,本標(biāo)準(zhǔn)采用的VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)方法，正是以上述理論為

3、依據(jù)，參照FDA方法而確立的，檢驗(yàn)時(shí)間為18 h24 h，并能準(zhǔn)確測出樣品中大腸埃希氏菌的CFU數(shù)值，操作簡便，但對于對染菌量低（如10 CFU/g）的樣品不如MPN法適用。,1 范圍,本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌（Escherichia coli）計(jì)數(shù)的方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸埃希氏菌的計(jì)數(shù)，其中大腸埃希氏菌平板計(jì)數(shù)法（第二法）不適用于貝類產(chǎn)品。,2 術(shù)語和定義,2.1 大腸埃希氏菌 Escherichia coli 大腸桿菌廣泛存在于人和溫血動物的腸道中，能夠在44.5發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽）生化試驗(yàn)為或的革蘭氏陰性桿菌。以此作為糞便污染指

4、標(biāo)來評價(jià)食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。,衛(wèi)生學(xué)意義,大腸埃希氏菌的某些菌株對人有致病性。相對于大腸菌群和糞大腸菌群，大腸埃希氏菌與糞便污染的相關(guān)性最好，應(yīng)用也最悠久。自1892年被提議作為糞便污染的指示菌以來，已被應(yīng)用了100多年。,3 設(shè)備和材料,除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 3.1 恒溫培養(yǎng)箱：361。 3.2 冰箱：25。 3.3 恒溫水浴箱：44.50.2 。 3.4 天平：感量為0.1g。 3.5 均質(zhì)器。 3.6 振蕩器。,3 設(shè)備和材料,3.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器

5、及吸頭。 3.8 無菌錐形瓶：容量500 mL。 3.9 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。 3.10 pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。 3.11 菌落計(jì)數(shù)器。 3.12 紫外燈：波長360nm366nm，功率6 W。,4 培養(yǎng)基和試劑,4.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯。 4.2 EC肉湯（E.coli broth）。 4.3 蛋白胨水。 4.4 緩沖葡萄糖蛋白胨水甲基紅(MR)和V-P試驗(yàn)用 。 4.5 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基。 4.6 磷酸鹽緩沖液。,4 培養(yǎng)基和試劑,4.7 伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂。 4.8 營養(yǎng)瓊脂斜面。 4.9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）。 4.10 VRBA

6、-MUG。 4.11 革蘭氏染色液。 4.12 Kovacs 靛基質(zhì)試劑。 4.13 無菌1 mol/L NaOH。 4.14 無菌1 mol/L HCl。,大腸埃希氏菌計(jì)數(shù),大腸埃希氏菌MPN計(jì)數(shù)（第一法） 大腸埃希氏菌平板計(jì)數(shù)法（第二法）,大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)：第一法,大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)：第一法,5.2 操作步驟,5.2.1 樣品的稀釋 5.2.1.1 固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000 r/min10 000 r/min均質(zhì)1min2 min，制成1:10 樣品勻液。 5.2.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225mL

7、磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。,5.2.1 樣品的稀釋,5.2.1.3 樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時(shí)分別用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)。 5.2.1.4 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1 mL無菌吸管或吸頭反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。,5.2.1 樣品的稀釋,5.2.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻

8、液。每遞增稀釋1次，換用1支1 mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。,5.2.2 初發(fā)酵試驗(yàn),每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1 mL（如接種量超過1 mL，則用雙料LST肉湯），36 1培養(yǎng)24 h2 h，觀察小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)48 h2 h。產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果。,5.2.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn),用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1

9、環(huán)，移種于已提前預(yù)溫至45 的EC肉湯管中，放入帶蓋的44.5 0.2 水浴箱內(nèi)。水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)24 h2h。 檢查小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未有產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h2 h。記錄在24 h和48 h內(nèi)產(chǎn)氣的EC肉湯管數(shù)。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行EMB平板分離培養(yǎng)。,EC肉湯,EC肉湯主要成分： 乳糖、膽鹽、胰蛋 白胨。 大腸埃希氏菌因分 解乳糖而產(chǎn)氣，使 小倒管中可見氣泡。,5.2.4 伊紅美藍(lán)平板分離培養(yǎng),輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養(yǎng)物分別劃線接種于EMB平板，36 1培養(yǎng)18 h24 h。觀察平板上有無具黑色

10、中心有光澤或無光澤的典型菌落。,EMB瓊脂,主要成分：乳糖、營養(yǎng)物質(zhì)。指示劑系統(tǒng)：伊紅和美藍(lán)。 原理：大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸，使伊紅與美藍(lán)結(jié)合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅、美藍(lán)二者的比例有關(guān)。 不發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的細(xì)菌，在堿性環(huán)境中不能使伊紅、美藍(lán)結(jié)合，因而形成無色的菌落。 部分大腸菌群的菌株在EMB上可形成紅色或粉紅色的菌落。（應(yīng)注意非典型的菌落）。,EMB瓊脂上大腸埃希氏菌典型菌與可疑菌落,典型菌落：具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。 非典型的可疑菌落：粉紅色，無黑心。,5.2.5 營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng),從每個平板上挑5個典型菌落，如無典型菌落

11、則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上36 1 ，培養(yǎng)18 h24 h。取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗(yàn),生化鑒定,取培養(yǎng)物進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)、MRVP試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)。大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌的生化鑒別見表1。 表1大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌得生化鑒別,生化鑒定,注1：如出現(xiàn)表1以外的生化反應(yīng)類型，表明培養(yǎng)物可能不純，應(yīng)重新劃線分離，必要時(shí)做重復(fù)試驗(yàn)。 注2：生化試驗(yàn)也可以選用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)等方法，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作,5.3大腸埃希氏菌MPN計(jì)數(shù)的報(bào)告,大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無胞桿菌，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC生化試

12、驗(yàn)為或。只要有1個菌落鑒定為大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌MPN值。,檢樣量的選擇,注1：本表采用3個稀釋度0.1 g(mL)、0.01g(mL)和0.001 g(mL)，每個稀釋度接種3 管。 注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1 g（mL）、0.1g(mL)和0.01 g(mL)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。,大腸埃希氏菌平板計(jì)數(shù)法（第二法）,制訂依據(jù),美國食品藥品管理局（F

13、DA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4：Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria,基本原理,4-甲基傘形酮-D-葡萄糖苷，英文縮寫MUG。是一種不產(chǎn)生熒光的底物。由于96%的大腸埃希氏菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基傘形酮游離出來，在366 nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光。觀察到藍(lán)色熒光即可認(rèn)為是大腸埃希氏菌陽性。MUG對大腸埃希氏菌的生長繁殖既沒有抑制作用也沒有促進(jìn)作用，對菌落形態(tài)也沒有影響。,大腸埃希氏菌平板計(jì)數(shù)法程序,檢樣25g

14、(mL)+225mL稀釋液 均質(zhì)10倍系列稀釋 選擇23個適宜稀釋度的樣液，接種VRBA-MUG平板 361 1824h 紫外光照射，計(jì)數(shù)發(fā)熒光菌落 報(bào)告結(jié)果,6.2 操作步驟,6.2.1 樣品的稀釋，按5.2.1進(jìn)行。 6.2.2 平板計(jì)數(shù) 6.2.2.1 選取2個3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時(shí)取1 mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照。,6.2 操作步驟,6.2.2.2 將10 mL15 mL冷至450.5的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。 6.2.2.2 待瓊脂凝固后，再加3mL4 mL VRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固后翻轉(zhuǎn)平板，36 1 培養(yǎng)18 h24 h。,6.3平板菌落數(shù)的選擇,數(shù)在10 CFU100 CFU之間的平板，暗室360nm366nm 波長紫外燈照射下，計(jì)數(shù)平板上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。,6.2 操作步驟,檢驗(yàn)時(shí)用已知MUG陽性菌株（如大腸埃希氏菌ATCC25922）和產(chǎn)氣腸桿菌（如 ATCC 130