1、液相色譜知識及應(yīng)用化學(xué)室車寶泉,第一部分:液相色譜簡介,HPLC的儀器配置及流程,等度及高壓梯度泵系統(tǒng),由一個或數(shù)個高壓泵組成 每臺泵輸送一種溶劑 擴展性強，組合靈活 特點: 一般可耐6000psi反壓 流速在0.1到5ml/min 設(shè)定范圍可低至1l 或高至10ml,低壓梯度系統(tǒng),由一個高壓泵組成 單泵可運行梯度 可運行三元或四元梯度 單鍵盤控制 需要較好的脫氣方法 一般要氦氣或脫氣機脫氣,有機溶劑/水的混合物產(chǎn)生高粘度 導(dǎo)致高反壓,水與有機溶劑混合時的粘度,1 儀器方面 儀器模塊化，一體化， 毛細(xì)管HPLC 2. 儀器聯(lián)用技術(shù)發(fā)展液相色譜質(zhì)譜液相色譜核磁共振光譜 液相色譜-氣相色譜等,液相

2、色譜進展,3 色譜柱填料 不銹鋼, 高分子聚合材料 三氧化二鋁 4. 快速分析 采用細(xì)內(nèi)徑，提高靈敏度細(xì)粒度填料(1-3 m),提高柱效，短色譜柱快速分離新裝填方法：整體柱2分內(nèi)分離10種化合物,第二部分,液相色譜常用的色譜柱,對液相色譜柱的了解,從色譜方法上分： 正相/反相，離子交換，分子體積排除，親合，疏水回受 從柱子類型上分： 分配/吸附，離子交換，凝膠，親合 從柱體積及柱結(jié)構(gòu)上分： 內(nèi)徑 微徑柱2mm以下 分析柱3.9-7.8mm 制備柱7.9-50mm 長度5cm-60cm 從柱體材料上分： 不銹鋼（普通/可換柱芯），玻璃，聚合物（徑向加壓）,高效液相色譜柱概況,常見的分配柱填料,液

3、相色譜填料的種類,碳十八柱（ODS/C18） 碳八柱（Octyl/C8） 碳六柱（Hexyl/C6） 碳四柱（Butyl/C4） 碳一柱（Methyl/C1） 常見的吸附柱填料 硅膠柱,陰離子交換柱（SAX） 陽離子交換柱（SCX） 苯基柱（Phenyl） 氨基柱（Amino/NH2） 氰基柱（Cyano/CN/Nitrile）,不同品牌色譜柱,硅膠的基質(zhì)不同 主要是硅膠的純度差異 硅膠純度越高，性能越好 含碳量不同（C%） 填料的表面積不同（m2/g） 端基封口與否 填料的孔徑差異（） 填料的顆粒度差異（）,色譜柱保護,過濾所有的溶劑和樣品 使用保護柱 儀器在使用完畢，沖洗整個系統(tǒng)中的緩沖液

4、 柱子不使用時，兩端密封保存。 在適當(dāng)?shù)娜軇┲斜４嫔V柱 注意色譜柱的pH使用范圍，不用高壓沖洗色譜柱，不再高溫下過長時間使用硅膠鍵合相,第三部分:知識及應(yīng)用,幾個重要概念 液相色譜定性應(yīng)用 液相色譜定量應(yīng)用,概念:色譜條件,示例: 用氰基鍵合硅膠為填充劑；0.01mol/L庚烷磺酸鈉溶液(用20磷酸調(diào)節(jié)PH值至2.7乙腈(1: 1)為流動相，檢測波長為267nm。 正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達(dá)

5、到系統(tǒng)適用性試驗的要求。但對某些品種，必須用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求，可在該品種項下注明。,概念:系統(tǒng)適用性實驗,理論板數(shù)按利血平計算應(yīng)不低于2000，利血平峰與其它色譜峰的分離度應(yīng)符合要求。 色譜中最難分離物質(zhì)對或與其相關(guān)的物質(zhì)對的分離度和待測物響應(yīng)值的重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗的重要參數(shù)。 按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進行試驗和調(diào)整，應(yīng)符合要求；或規(guī)定色譜條件下的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。,系統(tǒng)適用性實驗,理論板數(shù):（n） 量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應(yīng)取相同單位）和半高峰寬（Wh/2）， 按

6、n5.54（tR/Wh/2）2計算色譜柱的理論板數(shù)，,系統(tǒng)適用性實驗,分離度 計算公式為： R= 2(TR2-TR1)/(W1+W2) 式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間； tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。,系統(tǒng)適用性實驗,重復(fù)性: 各品種項下的對照溶液，連續(xù)進樣35次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。 拖尾因子: 為保證測量精度，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子 （T）是否符合各品種項下的規(guī)定，,定性方法：,鑒別正反應(yīng)： 通常在相同色譜條件下，供試品和對照品保留時間的偏差在2以內(nèi)，則鑒別正反應(yīng)。 還

7、可通過在供試品中加入對照品，供試品色譜峰無分岔現(xiàn)象來證明。 假陽性: 顯色、沉淀 假陰性：檢測限因素、樣品復(fù)雜性干擾,應(yīng)用實例,1. 食品、保健品中添加枸櫞酸西地那非的鑒別。 2. 三七粉中添加 醋酸地塞米松的鑒別。 3. 抗癲癇中藥添加苯巴比妥的鑒別。 4. 中藥制劑中摻加降糖類西藥的鑒別。,單一HPLC鑒別有局限性需結(jié)合以上方法可以和薄層色譜，二極管陣列檢測器陣列。* 要做到100確定，必須和質(zhì)譜結(jié)合進行,光電二極管矩陣檢測器,定量方法：HPLC為首選容量分析、紫外光譜法的局限性實例醋酸地塞米松片：紫外光譜法不法廠家用醋酸潑尼松代替鹽酸小檗堿片：滴定法，廣東一廠家連續(xù)生產(chǎn)摻偽，含大量雜質(zhì)

8、抗生素,定量方法,標(biāo)準(zhǔn)曲線法，分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法： 外標(biāo)法 在液相色譜中用得最多 內(nèi)標(biāo)法 準(zhǔn)確，但是麻煩 在標(biāo)準(zhǔn)方法中用得最多,外標(biāo)法定量（二）,采集不同濃度標(biāo)樣的色譜圖 積分，按外標(biāo)法定量計算，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線,第四部分:HPLC問題的故障排除,故障排除策略綜述 機械及化學(xué)因素對性能的影響 儀器譜帶展寬 系統(tǒng)檢測及優(yōu)化 色譜柱的性能 塔板數(shù)，死體積 色譜峰形問題,第二部分 保留時間重現(xiàn)性 溫度 有機相比例 pH 離子對 疏水塌陷 方法開發(fā)建議 額外的色譜峰（鬼峰）,合理的邏輯判斷 將會節(jié)省解決問題的時間,色譜問題的可能根源,流動相 進樣器 在線過濾器 色譜柱 檢測器 樣品,泵 保護柱

9、連接管線及接頭 積分儀/記錄儀/軟件,液相色譜對色譜泵的要求,影響液相色譜系統(tǒng)的數(shù)據(jù)精度的關(guān)鍵 以在任何情況下保持最高精度為目的 穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速 流速的重現(xiàn)性對定性及定量，特別是GPC的分子量分布的測定尤為重要 對壓力敏感的檢測器，如示差、電導(dǎo)及電化學(xué)，特別是粘度檢測器的影響很大。與質(zhì)譜聯(lián)用時尤為重要 有效的流速范圍（制備及微柱實驗時考慮） 可靠且充分的溶劑混合 準(zhǔn)確及重現(xiàn)的自動溶劑混合及梯度 滯后體積的合理性（梯度實驗時考慮）,簡化問題 評估對試驗室效率的影響 觀察色譜圖 嘗試分類問題 最先對最容易的部分進行故障排除 ,問題,故障排除的策略,色譜柱 保護柱 流動相 樣品/樣品瓶問

10、題,泵 進樣器 檢測器 數(shù)據(jù)采集,譜帶展寬 連接管路 色譜柱 樣品瓶,填裝良好的色譜柱在系統(tǒng)、連接狀況皆良好的狀況下，色譜峰形很好,良好的色譜結(jié)果,色譜圖中所有色譜峰變形,為什么色譜圖中的所有色譜峰都變形？ 機械問題 進樣器 色譜柱有死體積 連接有問題 化學(xué)問題 溶解樣品的溶劑太強 其他的綜合因素 色譜柱頭的污染、部分堵塞,色譜柱內(nèi)空隙 高反壓，扭曲的或雙峰,相似的變化,所有色譜峰都變壞的機械問題,所有色譜峰都變壞的機械問題,譜帶展寬（Band Spreading）: 被測樣品譜帶變形/加寬 嚴(yán)重者出現(xiàn)雙峰 特點：所有的色譜峰的表現(xiàn)形狀相似 展寬是以下兩種因素的綜合結(jié)果： 儀器/系統(tǒng)影響 色譜

11、柱的影響,進樣體積 進樣器（密封墊問題） 連接管線，特別是： 進樣器至色譜柱 色譜柱至檢測器 接頭及篩板 檢測器的檢測池體積 色譜柱本身 色譜柱內(nèi)的死體積 篩板阻塞,注意：譜帶最早由進樣器產(chǎn)生,注意：這是最常見的問題,柱外譜帶展寬的機械因素,下圖是用0.04內(nèi)徑的管路連接時測柱效的色譜圖： 柱效：4000,上圖是用0.009內(nèi)徑的管路連接時測柱效的色譜圖： 柱效：1,1000,注：使用相同色譜柱,實例：管線內(nèi)徑對柱效的影響, 在色譜柱與進樣器之間使用不同內(nèi)徑的管線,柱頭有死體積 - Channeling,填料塌陷,色譜柱本身的問題：柱塌陷,色譜柱塌陷的影響及原因,雙峰及前沿峰 所有色譜峰皆受影

12、響 色譜柱自身毀壞，化學(xué)傷害 pH 8 硅膠基質(zhì)被溶解 色譜柱自身毀壞，機械損傷 壓力的突然變化、超壓 色譜柱中出現(xiàn)裂縫,硅膠溶解,鍵合相水解,傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)填料的pH局限性,注：有時此現(xiàn)象被稱為色譜柱流失（“Column Bleed”），當(dāng)配體水解不斷進行時，色譜峰的保留會降低，堿性物質(zhì)的色譜峰形可能會變差 。,低pH下鍵合相的水解,色譜峰形欠佳的其它原因,色譜峰形問題：展寬且拖尾的色譜峰 色譜柱進口過濾器（篩板）部分阻塞 卸下接頭，清洗或更換篩板 在線過濾器污染 更換篩板 保護柱污染 更換保護柱或柱芯,所有色譜峰都變壞的化學(xué)問題,溶解樣品的溶劑不正確 洗脫強度比流動相強,色譜圖中某些色譜峰變

13、形,為什么得到一個或一些變形的色譜峰? 主要的影響因素是化學(xué)問題 某一個樣品組分與顆粒表面發(fā)生陽離子交換 色譜柱的本身性質(zhì)或化合物的本身性質(zhì)所引起的化學(xué)問題 樣品在色譜柱上過載 樣品引起的化學(xué)問題 濃度過載 體積過載,這些色譜峰峰形良好,此化合物因化學(xué)問題導(dǎo)致拖尾，主要原因是錯誤地選擇了填料或流動相pH,某些色譜峰變壞：化學(xué)問題,一些色譜峰峰形很好，但某一個或幾個色譜峰峰形差 化學(xué)問題（非機械問題） 由于第二種相互作用的發(fā)生使堿性物質(zhì)峰形拖尾，因而導(dǎo)致：積分誤差、分離度降低、靈敏度降低,樣品與鍵合相的疏水相互作用,疏水相互作用及 與帶電位點的離子交換作用 with Charged Sites,

14、Base,Base,拖尾且在HPLC中保留過長,上述實驗使用了兩個相同的普通C8色譜柱,HPLC混合模式的保留導(dǎo)致拖尾,Time (min),50,普通 C18,現(xiàn)代 C18 （高純硅膠）,中性物質(zhì),堿性物質(zhì),中性物質(zhì),堿性物質(zhì),0,pH 7,不同品牌色譜柱的硅醇基活性的差異,堿性物質(zhì)拖尾的解決方案,色譜柱或填料的品牌/流動相的pH值,當(dāng)上樣量超過一定限度時發(fā)生 注意峰起點提前，注意：分析與制備之色譜峰的落點位于相同保留時間,色譜柱上的樣品濃度/質(zhì)量過載,常見HPLC問題的故障排除,第一部分 故障排除策略綜述 機械及化學(xué)因素對性能的影響 儀器譜帶展寬 系統(tǒng)檢測及優(yōu)化 色譜柱的性能 塔板數(shù)，死體

15、積 色譜峰形問題,第二部分 保留時間重現(xiàn)性 溫度 有機相比例 pH 離子對 疏水塌陷 方法開發(fā)建議 額外的色譜峰（鬼峰）,保留時間重現(xiàn)性,重現(xiàn)性 流動相比例 溫度 pH 離子對 梯度試驗的平衡時間,峰漂移 平衡 固定相穩(wěn)定性 色譜柱污染 疏水塌陷 使用含碳量較高的色譜柱時 使用有機相比例低于5%的流動相時,注意：首先要排除色譜泵的因素！,所有色譜峰保留時間加長或縮短 泵流速問題 檢測實際泵流量 體積/時間 錯誤的色譜柱類型 與C18相比，C8保留較弱。或不同品牌（含碳量不同）的C18柱 溫度問題 溫度升高，保留變短，溫度降低，保留加長 流動相中有機相的比例 有機相比例增加，保留時間降低 有機相

16、比例降低，保留時間增加,保留時間變化,保留時間重現(xiàn)性,非色譜柱因素： 溶劑（有機相）組成 溶劑體積%對保留因子k有指數(shù)關(guān)系的影響 溶劑組成每變化1%，保留時間變化5%到15% 在使用含碳量較高的色譜柱、流動相中含有大量水相時，產(chǎn)生鍵合相疏水塌陷的現(xiàn)象,流動相配制,應(yīng)清楚明確地指明流動相的配制方法 指明：是將甲醇加入到水中，還是將水加入到甲醇中，抑或是分別用量筒量出一定量的甲醇及水倒入另一容器中 pH測量：應(yīng)該在加入有機相之前測量pH 當(dāng)溫度波動時，用溶劑稱重的方法會使配比更精確些,保留時間變化,有些色譜峰保留時間加長或縮短 化學(xué)問題 梯度的平衡時間不足 色譜柱的類型不對，與C18相比，CN的選

17、擇性有差異；或色譜柱的品牌不對 pH不正確或緩沖液沒有緩沖能力 流動相中有機相的比例不對，或有機溶劑的類型不對,保留時間重現(xiàn)性：pH,非色譜柱因素 中性物質(zhì)：無影響 酸性物質(zhì)：pH增加，保留降低 堿性物質(zhì)：pH增加，保留提高降低 有時；流動相有0.1pH值的變化，會導(dǎo)致高達(dá)10%的保留時間變化 流動相pH在樣品的pKa值的1之內(nèi)保留時間變化最大,pH,容量因子 (k),酸性物質(zhì)未電離酸,離子化的酸, 2 pH 單位 = 99% 未離子化,+ 2 pH單位= 99% 離子化,pKa, 2 pH 單位以外可獲得更穩(wěn)定的保留 (重現(xiàn)性更好),穩(wěn)定區(qū)域：方法穩(wěn)定性更好,保留時間重現(xiàn)性,非色譜柱因素：

18、離子對試劑（例如：己烷磺酸 PIC B6） 對保留時間的影響 在低濃度下，離子對試劑濃度增加，保留增加 在高濃度下，離子對試劑的濃度對保留幾乎無影響 需要長時間的平衡 由于固定相吸附試劑（平衡可能需要使用多達(dá)500個柱體積的流動相）,使用離子對流動相的色譜柱 明顯需要較長的平衡時間 因為，一般在一個色譜柱中： 1 mol/m2 300 m2/g 2 g 表面覆蓋率 硅膠表面積 色譜柱中的填料量 覆蓋此色譜柱需要相當(dāng)于600moles的離子對試劑，如果流動相中PIC試劑的濃度是每升1mM，就需要600ml溶劑 在1ml/min流速下，需要600分鐘（10小時）,離子對法的平衡,樣品中不含有離子對試劑,離子對色譜比較常見的現(xiàn)象 負(fù)峰，主要原因是樣品溶劑的問題,負(fù)峰（等度色譜）,疏水塌陷,當(dāng)使用有機相比例較低的流動相（極性較高的）時，觀察到保留完全喪失的現(xiàn)象 使用含碳量較高的色譜柱時經(jīng)常發(fā)生 實例：使用100%水溶液流動相，進樣77針，運行時間超過20小時，保留時間皆比較穩(wěn)定 但當(dāng)停止流速后，重新再加上流速時，保留喪失。此現(xiàn)象表明：當(dāng)色譜柱卸壓時，流動相被排出孔,停止輸液時，迫使水相流動相進入孔中的壓力降低為零。壓力降低時，疏水的孔表面會排斥極性流動相，使孔中不浸潤 “dewe