1、1,第十八章 高效液相色譜（ HPLC）,2,在已知化合物中能直接進行氣相色譜分析的化合物約占15，加上衍生化的化合物，也不過20左右。 高沸點、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定、離子型化合物、高聚物乃至生物大分子，很難用氣相色譜法分析。 在經(jīng)典的液體柱色譜法基礎(chǔ)上，采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，引入氣相色譜理論后發(fā)展起來的柱色譜技術(shù)稱為高效液相色譜法。 特點：應(yīng)用范圍廣，分離效率高，分析速度快，靈敏度高，操作自動化等。,3,第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型和原理,固定相 液液色譜、液固色譜 分離機制 基本類型：分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、空間排阻色譜 其他：化學(xué)鍵合相色譜、離子抑制色譜、離子

2、對色譜、親合色譜、手性色譜、膠束色譜、電色譜等。,一、高效液相色譜法的主要類型,4,二、化學(xué)鍵合相色譜法,以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法 （BPC） 在HPLC中應(yīng)用最廣 固定相：極性鍵合相 -CN, -NH2, 或二羥基等鍵合在硅膠表面 應(yīng)用：分離極性、中等極性的化合物,（一）正相鍵合相色譜法,5,（二）反相鍵合相色譜法,固定相：非極性鍵合相 十八烷基硅烷（C18）、辛烷基（C8）等鍵合在硅膠表面 流動相：水與水混溶的極性調(diào)整劑 甲醇水、乙腈水,6,溶質(zhì)的非極性部分在與極性溶劑分子間的排斥力的作用下，和鍵合相的烴基發(fā)生疏溶劑締合； 另一方面，溶質(zhì)的極性部分受到極性流動相的作用，有解締合作用。,

3、1. 疏溶劑理論,7,2. 保留行為的主要影響因素,（1）溶質(zhì)分子的結(jié)構(gòu) 溶質(zhì)的極性越弱，疏水性越強，則與固定相作用越強，k越大，tR也越大。 （2）流動相 流動相表面張力越高，k越大 流動相介電常數(shù)越大，k越大 水的表面張力最大，有機溶劑含量增加，k值變小 （3）固定相： 鍵合烷基碳鏈越長，疏水性越強，k越大,8,（三）反相離子對色譜法,在固定相上涂漬或流動相中加入與溶質(zhì)分子電荷相反的離子對試劑，來分離離子型或可離子化的化合物的方法稱為離子對色譜法 反相離子對色譜 固定相：C18或C8鍵合相 流動相：含有離子對試劑的有機溶劑水溶液 應(yīng)用 適用于有機酸、堿、鹽的分離，以及用離子交換色譜法無法分

4、離的離子型和非離子型混合物的分離，還可借助離子對的生成引入紫外吸收或發(fā)熒光的基團,9,1. 離子對模型,10,2. 影響容量因子的因素,（1）離子對試劑的種類和濃度 季銨鹽，分析帶負電荷的物質(zhì) 烷基磺酸鹽或硫酸鹽，分析帶正電荷的物質(zhì) 試劑濃度：在濃度較低時，濃度升高，k增大 試劑的烷基碳鏈越長，k越大 （2）流動相的pH 對弱酸、弱堿的保留有很大的影響,11,三、其他高效液相色譜法,離子交換色譜用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相，以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器 分類 抑制型（雙柱型）、非抑制型（單柱型） 應(yīng)用 無機和有機陰、陽離子，氨基酸，糖類，DNA和RNA的水解產(chǎn)物,（一）離子色譜法,1

5、2,如樣品為陽離子，用無機酸作為流動相，抑制柱為強堿性陰離子交換劑。 在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應(yīng)： R+OH- + H+Cl- R+Cl- + H2O R+OH- + M+Cl- M+ OH- + R+ Cl- 式中， R+OH- 為抑制柱中的陰離子交換劑， M+為被測陽離子。 抑制柱的作用：使流動相中的酸生成H2O，使流動相電導(dǎo)率大大降低；還使樣品陽離子從原來的鹽變成相應(yīng)的堿，提高了組分電導(dǎo)檢測的靈敏度。,13,（二）手性色譜法,利用手性固定相或手性流動相添加劑分離分析手性化合物的對映異構(gòu)體的色譜法 分離原理 對映異構(gòu)體與手性選擇物形成瞬間非對映立體異構(gòu)“配合物”，因穩(wěn)定性的不同而分離,14

6、,（三）親合色譜法,利用或模擬生物分子之間的專一性親合作用，從復(fù)雜生物試樣中分離和分析特殊物質(zhì)的一種色譜方法 應(yīng)用 生物大分子的分離和分析 在各種色譜法中，選擇性最高,15,第二節(jié) 高效液相色譜法的固定相和流動相,采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團鍵合在載體表面所形成的固定相為化學(xué)鍵合固定相 非極性鍵合相 C18 ODS、C8、C1、苯基 弱極性鍵合相 醚基、二羥基 極性鍵合相 Si(CH2)3NH2、 Si(CH2)2CN,一、化學(xué)鍵合相色譜法的固定相,（一）鍵合相的種類,16,（二）鍵合相的特點,1. 鍵合反應(yīng) 多為硅氧烷型鍵合相，以氯硅烷與硅膠反應(yīng)而得,2. 含碳量和覆蓋度 含碳量：對鍵合硅膠進

7、行元素分析得到 表面覆蓋度：參加反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例 封尾：殘余硅醇基的鈍化處理,17,二、化學(xué)鍵合相色譜法的流動相,18,選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題,（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（流動相在使用前需用微孔濾膜過濾，除去固體顆粒，還要進行脫氣）,（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。,（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。,（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。,19,（一）流動相對分

8、離的影響,其中n由固定相及色譜柱填充質(zhì)量決定，主要受溶劑種類的影響，k受溶劑配比的影響。 改變流動相中各種溶劑的配比，能改變其洗脫能力，組分的k也改變。,20,斯奈德溶劑極性參數(shù),為羅氏極性分配系數(shù)，下標(biāo)e、d、n分別代表乙醇、二氧六環(huán)和硝基甲烷 P值越大，則溶劑極性越強，正相洗脫能力越強,（二）溶劑的強度和選擇性,1. 溶劑的極性和強度,21,反相鍵合相色譜法的溶劑強度常用強度因子S表示。 S越小，溶劑極性越強，反相洗脫能力越弱。,反相色譜常用溶劑的強度因子,22,2. 混合溶劑的極性和強度,3. 溶劑的選擇性,23,常用溶劑的極性參數(shù)P和選擇性參數(shù),24,25,（三）流動相最優(yōu)化方法簡介,

9、優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)： 實現(xiàn)最難分離物質(zhì)在理想分離前提下的快速分離 實現(xiàn)最大整體分離效能前提下的快速分離 調(diào)節(jié)溶劑極性可使樣品組分的k值在適宜的范圍,26,例 在一反相色譜柱上，當(dāng)流動相為30甲醇和70水（體積比）時，某組分的保留時間為25.6min，死時間為0.35min。如何調(diào)整溶劑配比使組分的容量因子為5？,解,調(diào)整溶劑比例為75甲醇和25水，可使k為5,27,三、分離條件的選擇,1. 渦流擴散：固定相顆粒310um 2. 縱向擴散：很小，可忽略 3. 傳質(zhì)阻力 （1）固定相傳質(zhì)阻力 化學(xué)鍵合相色譜中，鍵合相多為單分子層，可忽略 （2）流動相傳質(zhì)阻力 與固定相顆粒粒度的平方成正比，與組分分子在流動相

10、中的擴散系數(shù)成反比,（一）高效液相色譜法中的速率理論,28,（3）靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻力 因固定相的多孔性導(dǎo)致流動相的滯留而形成的傳質(zhì)阻力 與固定相顆粒粒度的平方成正比，與組分分子在流動相中的擴散系數(shù)Dm成反比 流動相的粘度低，則Dm大，傳質(zhì)阻力小，所以常使用低粘度的甲醇、乙腈作溶劑,（4）固定相粒度對塔板高度的影響 粒度小有利于保證高效液相色譜的高柱效,29,（二）正相鍵合相色譜法的分離條件,分離含雙鍵的化合物，常用氰基鍵合相 分離多官能團化合物，常用氨基鍵合相 流動相：烷烴極性調(diào)節(jié)劑,（三）反相鍵合相色譜法的分離條件,ODS是應(yīng)用最廣的非極性固定相 短鏈烷基鍵合相可用于極性化合物的分離 苯基鍵

11、合相適用于芳香化合物和多羥基化合物 流動相：水甲醇、水乙腈 抑制劑：醋酸、氨水、磷酸鹽或醋酸鹽等，調(diào)pH，抑制組分離解，增強保留，減少脫尾。,30,（四）反相離子對色譜法的分離條件,（1）離子對試劑 分析酸、帶負電荷的物質(zhì)時，常用季銨鹽 分析堿、帶正電荷的物質(zhì)時，常用烷基磺酸鹽或硫酸鹽 （2）流動相的pH 調(diào)節(jié)pH，試樣組分和離子對試劑全部離子化 （3）有機溶劑及其濃度 有機溶劑的比例越高，極性越小，k越小 被測組分或離子對的疏水性越強，即極性越弱，需有機溶劑的比例越高,31,四、其它固定相,1. 鍵合型離子交換劑 在硅膠表面鍵合上各種離子交換劑 陽離子型鍵合相：強酸性磺酸型 -SO3H 陰離

12、子型鍵合相：季銨鹽型-NR3Cl 2. 手性固定相 蛋白類、多糖、環(huán)糊精、-氫鍵型、配體交換等 3. 親和色譜固定相 載體配基,32,分離方式的選擇,在選擇色譜分離方式 前要了解樣品性質(zhì)： （1）樣品是大分子還是小分子？分子量在什么范圍？ （2）樣品是水溶性的還是有機溶劑可溶的？ （3）樣品是離子狀態(tài)還是非離子狀態(tài)？,樣品,相對分子量 2000,相對分子量 2000,水溶,非水溶,水溶,非水溶,離子型,非離子型或可形成離子對,離子交換色譜或離子色譜,正相鍵合相色譜,溶于非極性或弱極性溶劑,（極性在CHCl3之下）,溶于中極性或極性溶劑,（極性在CHCl3之上）,反相鍵合相色譜,溶于CHCl3,

13、硅膠吸附色譜,正相鍵合相色譜,溶于醇、或乙酸乙酯,離子型,非離子型或可形成離子對,離子交換色譜,分子尺寸30nm,分子尺寸30nm400nm,反相鍵合相色譜,尺寸排阻色譜,分子尺寸30nm,分子尺寸30nm400nm,尺寸排阻色譜,反相鍵合相色譜,33,34,35,高效液相色譜儀器,36,高效液相色譜儀器,37,38,高效液相色譜儀器,39,第三節(jié) 高效液相色譜儀,輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜柱系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)記錄處理,40,一、輸液系統(tǒng),作用：輸送流動相通過整個色譜系統(tǒng) 壓力：150350105 Pa。 由于色譜柱很細，填充劑粒度小，柱阻大，必須有很高的柱前壓力，才能獲得高速的液流 要求：具

14、備較高的輸出壓力，流量精度高、穩(wěn)定、范圍寬 種類：恒壓泵 恒流泵柱塞往復(fù)泵,（一）高壓泵,41,42,（二）梯度洗脫裝置,等強度洗脫：在一個分析周期中，流動相組成保持恒定 梯度洗脫在液相色譜中的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫 梯度洗脫：在一個分析周期中，按一定程序連續(xù)改變流動相中兩種（或更多種）溶劑的組成和配比，使各組分都在適宜的條件下（k值范圍110）獲得分離 類型：高壓梯度、低壓梯度,43,外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。,內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,44,

15、二、分離和進樣系統(tǒng),（一）進樣器 1. 注射器 2. 六通進樣閥,45,（二）色譜柱,1. 構(gòu)造 由柱管（不銹鋼）和固定相組成 常規(guī)分析柱 25mm 1030cm 窄徑柱 12mm 1020cm 毛細管柱 0.20.5mm 310cm 類型：分析型、制備型,46,2. 性能評價 柱壓、H、n、k、R等 柱效：主要取決于柱填料（固定相）的性能和裝柱技術(shù) 3.預(yù)柱（保護柱） 連接在進樣器和色譜柱之間的短柱（35cm），防止來自流動相和樣品中不溶性微粒堵塞色譜柱。,47,三、檢測系統(tǒng),作用：把色譜洗脫液中組分的量（或濃度）轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴?要求：靈敏度高、響應(yīng)快、重現(xiàn)性好、線性范圍寬、適用范圍廣、死體

16、積小、對流動相流量和溫度波動不敏感等 通用型檢測器 示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器 專屬型檢測器 紫外檢測器、熒光檢測器、安培檢測器,48,（一）紫外檢測器,應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。 特點： 靈敏度高；線形范圍寬；流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）； 對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。,49,固定波長檢測器 可變波長檢測器 氘燈為光源 波長可任意選擇，采用樣品最大吸收波長為檢測波長，可增加靈敏度 光電二極管陣列檢測器 多通道檢測器 每一個二極管相當(dāng)于一個單色儀的出口狹縫 可獲得三維光譜色譜圖,紫外檢測器的類型,50,1024個二極

17、管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖。,光電二極管陣列檢測器,51,光電二極管陣列檢測器,52,（二）熒光檢測器,在紫外光的激發(fā)下能發(fā)熒光的化合物或能用衍生法制成熒光衍生物的物質(zhì)均可進行熒光檢測。 高靈敏度、高選擇性，比紫外檢測器的靈敏度高2個數(shù)量級。 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。,53,（三）示差折光檢測器,利用組分和流動相的折射率之差，進行檢測。 在適當(dāng)?shù)臈l件下對所有的溶質(zhì)都有響應(yīng)，應(yīng)用范圍寬。 對溫度和流速很敏感，靈敏度較低，不適用于梯度洗脫。,54,示差折光檢測器,55,示差折光檢測器,56,（四）電化學(xué)檢測器,

18、電導(dǎo)檢測器：主要用于離子色譜法 安培檢測器：測定能氧化、還原的物質(zhì)，應(yīng)用廣泛 原理：檢測池相當(dāng)于一個電解池。組分通過電極表面時，當(dāng)兩電極間施加大于該組分的氧化（或還原）電位的恒定電壓時，組分被電解而產(chǎn)生電流，服從法拉第定律。,工作電極,入口,出口,參比電極,輔助電極,57,（五）蒸發(fā)光散射檢測器,適用于：揮發(fā)性低于流動相的組分 通用型檢測器 流出物霧化室霧滴溶劑蒸發(fā)溶質(zhì)氣溶膠光散射光電倍增管檢測散射光 散射光的對數(shù)響應(yīng)值與組分的質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系,流出物,氮氣,霧滴,蒸發(fā)室,氣溶膠,泵,光束,58,蒸發(fā)光散射檢測器 ELSD,59,ELSD的檢測過程,惰性氣體使色譜柱流出物霧化,在漂移管中把

19、流動相蒸發(fā),測定留下來的樣品顆粒的光散射,60,兩種類型的ELSD,61,四、數(shù)據(jù)記錄處理和計算機控制系統(tǒng),色譜管理軟件可實現(xiàn)全系統(tǒng)的自動化控制 自動采集和分析色譜數(shù)據(jù)，色譜工作站是數(shù)據(jù)采集、處理和分析的獨立的計算機軟件,62,第四節(jié) 高效液相色譜分析方法,1. 色譜鑒定法 2. 化學(xué)鑒定法 3. 兩譜聯(lián)用鑒定法,一、定性分析方法,63,二、定量分析方法,1. 外標(biāo)法 外標(biāo)校正曲線法 A=a+bC 2. 內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)校正曲線法 Ai/As=a+bCi 內(nèi)標(biāo)對比法 3. 內(nèi)加法 將待測組分i的對照品加入待測樣品中，測定峰面積的增量，求算i組分的含量。,例 稱取二甲苯試樣110.0mg，加入對二甲苯對照品30.0mg，用反相色譜法測定，加入對照品前后的色譜峰面積（mm2） ：對二甲苯為40.0和104.2，間二甲苯為141.8和156.2。計算對二甲苯的百分含量。,解,64,例 測定生物堿試樣中黃連堿和小檗堿，稱取內(nèi)標(biāo)物，黃連堿和小檗堿的對照品各0.2000g配成溶液