1、基因工程的基本操作程序,善假于物也,補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn):,啟動(dòng)子,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子)。,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,非編碼序

2、列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,轉(zhuǎn)錄,翻譯,轉(zhuǎn)錄,翻譯,1下列關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)中，正確的是 （ ） A大豆基因中內(nèi)含子是能夠編碼蛋白質(zhì)的序列 B乳酸菌與酵母菌基因結(jié)構(gòu)中都存在外顯子和內(nèi)含子 C大腸桿菌基因與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)位于編碼區(qū)的下游 D水稻細(xì)胞基因的編碼區(qū)中存在非編碼序列 2（多選）原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是 （ ） A編碼區(qū)都有能編碼蛋白質(zhì)的序列 B編碼區(qū)都是連續(xù)的 C非編碼區(qū)都能調(diào)控遺傳信息的表達(dá) D非編碼區(qū)都有RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn),D,ACD,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體

3、的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,1.基因工程的操作步驟正確的操作順序是 使目的基因與運(yùn)載體相結(jié)合將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 檢測(cè)目的基因的表達(dá)是否符合特定性狀要求 提取目的基因 A B C D,目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。,基因操作的基本步驟,一、提取目的基因 將需要的基因從供體生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)。,一、提取目的基因,1、目的基因主要是指_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子,2、獲取目的基因的常用方法,（1）從基因文庫(kù)中獲取,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,（3）人工合成,(

4、1)從基因文庫(kù)中獲取目的基因,什么是基因文庫(kù)？ 什么是部分基因文庫(kù)？ 怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因？ 目的基因的有關(guān)信息與什么相聯(lián)系？,概念：基因文庫(kù) （gene library）,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(kù)(gene library),基因組文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù). 部分基因文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).,基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系,思考：基因文庫(kù)如何構(gòu)建？,將某種生物體內(nèi)的DNA全部提取出來(lái)，選

5、用適當(dāng)?shù)南拗泼福?將DNA切成一定范圍大小的DNA片段，然后，將這些DNA 片段分別與載體連接起來(lái)，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，每個(gè) 受體菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是說(shuō)，這個(gè)群體 包含了這種生物的所有基因，這樣就構(gòu)建成了生物的基因組文庫(kù)。這種方法稱直接分離法（或鳥槍法）,如果用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 多種互補(bǔ)DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，那么，這個(gè)受體菌群體就構(gòu)成了這種生物的cDNA文庫(kù)。這種方法稱反轉(zhuǎn)錄法,基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建,鳥槍法：,(直接分離法),用 限 制 酶 切 成 許 多 片 斷,該法最大的缺點(diǎn)是帶有很大的盲目性，工

6、作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。,cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,反轉(zhuǎn)錄法：,基因組DNA文庫(kù),cDNA文庫(kù),基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較,（3）如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。,1、構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞的 A、染色體DNA B、線粒體DNA C、總mRNA D、tRNA,2、目的基因可從基因文庫(kù)中獲得，下列有關(guān)基因文庫(kù)的描述正確的是 A、某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫(kù) B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，

7、導(dǎo)入某個(gè)生物 體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫(kù) C、含有一種生物所有基因的基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù) D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫(kù)叫cDNA文庫(kù),A,C,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過(guò)此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。,PCR技術(shù),原理： 前提： 原料 方式,PCR擴(kuò)增儀,DNA復(fù)制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式擴(kuò)增， 即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子,過(guò)程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單

8、鏈DNA 退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合 延伸：加熱至7075以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈,1、在遺傳工程中，若有一個(gè)控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTGTACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是 雙鏈DNA分子為模板 ATGTG或TACAC模板鏈 四種脫氧核苷酸 四種核苷酸 DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶引物 溫度變化 恒溫 A B C D,D,2、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是460個(gè)）放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷

9、酸的個(gè)數(shù)是 A.540個(gè) B.8100個(gè) C.17280個(gè)D.7560個(gè),B,3 、人工合成,根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測(cè),推測(cè),目的基因,化學(xué)合成,1、在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是 A、化學(xué)合成法 B、基因組文庫(kù)法 C、cDNA文庫(kù)法 D、聚合酶鏈反應(yīng),2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是 從基因文庫(kù)中獲取目的基因 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 反轉(zhuǎn)錄法 通過(guò)DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成 A B C D,A,D,(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心,（1）用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_

10、。 （2）用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。,（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,1.過(guò)程:,質(zhì)粒,目的基因,限制酶處理,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,兩個(gè)切口 獲得目的基因,DNA連接酶,表達(dá)載體,同一種,1.過(guò)程:,1. 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合所需的條件有 同一種限制酶 具有抗性基因的質(zhì)粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA連接酶 四種脫氧核苷酸 ATP A B C D,D,a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代,b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用,思考：作為基因

11、工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？,不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是： （1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)； （2） 通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄； （3） 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記； （4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等； （5） 有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或

12、做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,3.基因表達(dá)載體的組成：,它們有什么作用？,a、目的基因,b、啟動(dòng)子,c、終止子,d、標(biāo)記基因,位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點(diǎn),位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄,檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,1、（多選）一個(gè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括 A目的基因 B啟動(dòng)子 C終止子 D標(biāo)記基因,ABCD,2、下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是 A啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼 B啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用 C標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選 D基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞

13、及導(dǎo)入方式不同而有所差別,A,常用的受體細(xì)胞：,有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點(diǎn):,能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子葉植物無(wú)感染能力,Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上,轉(zhuǎn)化過(guò)程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,植物細(xì)胞,植物細(xì)胞染色DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,（2）基因槍法,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法

14、。,（3）花粉通道發(fā),植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,方法:,顯微注射技術(shù),操作程序:,提純含目的基因表達(dá)載體,取受精卵,顯微注射,移植到子宮,受精卵發(fā)育,新性狀動(dòng)物,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,常用法：Ca2+處理,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細(xì)胞原因： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,過(guò)程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)

15、菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是 A結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便 B繁殖速度快 C遺傳物質(zhì)含量少、簡(jiǎn)單 D性狀穩(wěn)定、變異少 2、基因工程常用的受體細(xì)胞有 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動(dòng)植物細(xì)胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 A.人工合成基因 B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá),C,8. 采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是 將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，

16、注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)人細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng) A B C D,C,(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢測(cè),導(dǎo)入檢測(cè)：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,方法,DNA分子雜交,表達(dá)檢測(cè),轉(zhuǎn)錄檢測(cè)分子雜交,翻譯檢測(cè)抗原抗體雜交,分子檢測(cè)法,鑒定,抗蟲鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等,個(gè)體水平的鑒定,知識(shí)延伸DNA分子雜交技術(shù),該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,返 回,DNA,附著在膜上,硝化纖維素,

17、加探針,報(bào)告基因（含熒光素分子）,變性,DNA雜交 （如檢測(cè)SARS病毒等）,a,b,c,d,1.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,2.-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想

18、，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？,尋根問(wèn)底：,1.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,2.-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？,尋根問(wèn)底：,復(fù)習(xí)題,1.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞有哪些方法?(試舉例說(shuō)明),2.簡(jiǎn)述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,3.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個(gè)抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?,要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物； 要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。,4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目