1、CRISPR/Cas9系統(tǒng),第三小組 找資料：李瑤 王辰尹 鄭小云 整理資料：王桂玉 段林菲 劉成鳳 PPT制作：張龍 勉惠 龍歡 匯報(bào)：辛國(guó)琴,目錄,簡(jiǎn)介,作用過(guò)程,應(yīng)用與前景,一、簡(jiǎn)介,1、引入： 基因定點(diǎn)修飾是研究基因功能的重要手段之一也可被用于人類(lèi)遺傳性疾病的治療，因此這類(lèi)技術(shù)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。早期僅基于同源重組的基因打靶技術(shù)效率極低，應(yīng)用受到限制。直到人工核酸內(nèi)切酶出現(xiàn)，將這一現(xiàn)狀徹底改變。,一、簡(jiǎn)介,2、簡(jiǎn)介： 人工核酸酶的原理是一樣的，都是由DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶融合而成。 2013年初，一種全新的人工核酸內(nèi)切酶 CRISPR/Cas9 它主要是基于細(xì)菌的一種獲得

2、性免疫系統(tǒng)改造而成，其特點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單、成本低、作用高效。,一、簡(jiǎn)介,CRISPR 全名：clustered regularly interspaced short palindromic repeats 即成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，是基因組中一個(gè)含有多個(gè)短重復(fù)序列的位點(diǎn)，這種位點(diǎn)在細(xì)菌和古細(xì)菌胞內(nèi)起到了一種獲得性免疫（acquired immunity）的作用。 CRISPR系統(tǒng)主要依賴(lài)crRNA和tracrRNA來(lái)對(duì)外源DNA進(jìn)行序列特異性降解。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種 CRISPR/Cas系統(tǒng)， TypeI，TypeII，Type3 ，其中TypeII系統(tǒng)是目前改造最為成功的人工核酸酶

3、，因?yàn)槠渲恍枰粋€(gè)Cas9蛋白就能夠發(fā)揮CRISPR系統(tǒng)的免疫作用,3、該系統(tǒng)的工作原理： crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。,一、簡(jiǎn)介,一、簡(jiǎn)介,二、作用過(guò)程,二、作用過(guò)程,獲得CRISPR的間隔區(qū) 細(xì)菌通過(guò)將入侵的噬菌體或質(zhì)粒的一小段DNA序列整合到自身基因組的重復(fù)序列之間，即CRISPR 5端的兩個(gè)重復(fù)序列之間，從而獲得高度可變的間隔區(qū)域,因此，CRISPR基因

4、座中的間隔序列從5到3的排列也記錄了外源遺傳物質(zhì)入侵的時(shí)間順序。 噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對(duì)應(yīng)的序列被稱(chēng)為protospacer，通常protospacer的5或是3端延伸幾個(gè)堿基序列很保守，被稱(chēng)為PAM，它的長(zhǎng)度一般為25堿基，一般與protospacer相隔14堿基。,二、作用過(guò)程,CRIPSR基因座的表達(dá)與crRNA 的成熟 CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA，然后在Cas9和核酸酶的作用下被剪切成成熟的crRNA,基因座結(jié)構(gòu),CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單 以產(chǎn)膿鏈球菌的典型TypeIICRISPR/Cas為例,二、作用過(guò)程,CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)外

5、源遺傳物質(zhì)的切割 成熟的tracrRNA、crRNA和Cas9形成核糖核蛋白復(fù)合物，crRNA識(shí)別外源匹配的DNA序列并與之結(jié)合，從而介導(dǎo)核糖核蛋白復(fù)合物對(duì)外源遺傳物質(zhì)的切割.,三、應(yīng)用與前景,雖然CRISPR/Cas的研究還處于初始階段，但是其已經(jīng)被應(yīng)用在工業(yè)、學(xué)術(shù)和醫(yī)療領(lǐng)域。 工業(yè)上：利用該系統(tǒng)構(gòu)建出具有噬菌體抗性的菌株以提高奶制品發(fā)酵的產(chǎn)量。也能把它的這種特性用于菌株分類(lèi)，以及防止某些特殊質(zhì)粒的擴(kuò)散，防止基因污染，以保存菌株。 研究上：CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅可以用來(lái)進(jìn)行基因敲除，還可以敲入基因?？梢栽贑RISPR/Cas系統(tǒng)切割目的基因的同時(shí)，通過(guò)同源重組修復(fù)斷點(diǎn)的原理引入特定突變

6、或者插入目的基因片段。該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于細(xì)菌、斑馬 魚(yú)、果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)、酵母、小鼠、人類(lèi)細(xì)胞以及水稻等。,醫(yī)療上：還可以用在細(xì)胞水平建立疾病模型，治療遺傳疾病以及進(jìn)行細(xì)胞替代治療。HIV-1病毒有時(shí)能以休眠狀態(tài)存在于人類(lèi)宿主細(xì)胞中，如果將LTR-targeting CRISPR/Cas9復(fù)合物導(dǎo)入HIV病毒或者已經(jīng)誘導(dǎo)的T細(xì)胞中，可以使HIV失去致病性。更重要的是，該復(fù)合物甚至能夠剪切己經(jīng)插入宿主染色體上的病毒基因。,三、應(yīng)用與前景,三、應(yīng)用與前景,CRISPR/Cas9作為第三代人工核酸酶成為目前研究的熱點(diǎn)，相對(duì)于ZFN和TALEN有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)： a構(gòu)建簡(jiǎn)單方便快捷，適用于任何分子生物實(shí)驗(yàn)室； b用于基因組的點(diǎn)突變編輯優(yōu)于ZFN或TALEN； cCRISPR/Cas9精確的切口酶活性用于基因治療安全性高于ZFN或TZLEN。,CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種新型的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，它的出現(xiàn)大大推動(dòng)了對(duì)基因功能的研究。但作為一種新興的技術(shù)，它的基礎(chǔ)理論研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，很多分子機(jī)制尚不明確，技術(shù)也不夠成熟。盡管現(xiàn)在還存在諸如如何將構(gòu)建的系統(tǒng)成功