1、1,膠體金診斷試劑工藝配方原則,2,內(nèi) 容,一、和膜相關(guān)的配方和原理 二、和金子墊相關(guān)的配方和原理 三、和樣品墊相關(guān)的配方和原理 四、相關(guān)問題,3,一、和膜相關(guān)的配方和原理,電鏡下的NC膜,4,硝酸纖維膜生產(chǎn)工藝圖,5,孔徑定義的問題,6,孔徑對側(cè)向?qū)游鏊俣鹊挠绊?7,不同種類膜的 IgG結(jié)合能力,8,不同種類膜的 BSA結(jié)合能力,9,為什么蛋白會結(jié)合到膜上?,結(jié)合力是什么? 靜電 疏水力 這兩種結(jié)合力的效應(yīng)是什么? 使蛋白從溶液中分離出來 長久結(jié)合作用,10,靜電作用力 靜電作用力是正負(fù)電荷相互吸引產(chǎn)生的作用力 疏水作用力 疏水作用力又稱為疏水鍵。它是由側(cè)鏈的疏水基團(tuán)相互接近. 而形成的一種

2、作用力。對維持分子的三、四級結(jié)構(gòu)起著重要的作用。每一個蛋白質(zhì)都具有疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)。,11,蛋白質(zhì)疏水性狀和親水性狀 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解在溶劑中時，蛋白質(zhì)處于非常穩(wěn)定的狀態(tài)，此時蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)展開在外，疏水基團(tuán)收縮在內(nèi)，親水基團(tuán)和水分子接觸，保證了溶解性的狀態(tài)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)沉淀出來時，疏水基團(tuán)展開，親水基團(tuán)收縮，此時為疏水狀態(tài)，也呈現(xiàn)不穩(wěn)定的固體狀態(tài)，疏水基團(tuán)和其他固體物的疏水基團(tuán)通過疏水作用力結(jié)合，達(dá)到固定的目的。,12,蛋白結(jié)合到固相材料上,蛋白結(jié)合到固相材料上是一個多步驟過程 取決于 蛋白溶液擴(kuò)散到固相表面 蛋白從溶液中分離出來 蛋白吸附到固相上 蛋白重排到最低能態(tài),13,吸附過程,溶液中的蛋

3、白,14,多位點(diǎn)結(jié)合,只有1個位點(diǎn)的結(jié)合是可逆的,多位點(diǎn)結(jié)合使得蛋白穩(wěn)定在固相表面， 即使其中的每個單位點(diǎn)都是可逆的,15,影響蛋白結(jié)合的因素,蛋白緩沖液 使用的膜 蛋白自身 應(yīng)用體系,16,蛋白緩沖液,沒有通用的緩沖液，不同的系統(tǒng)必須分別優(yōu)化。 作用：提供適合的PH, 改善親水性, 增溶性,提高穩(wěn)定性 定律: “蛋白在緩沖液中越不穩(wěn)定，蛋白結(jié)合力越強(qiáng)”,17,緩沖液的優(yōu)化,離子強(qiáng)度 對于蛋白從溶液中脫離出來很重要，少量的離子強(qiáng)度，蛋白難以從溶液中脫離沉淀出來，過量的的離子強(qiáng)度，溶液配制中就已會出現(xiàn)沉淀。 pH 蛋白在等電點(diǎn)最不穩(wěn)定 沉淀劑 通常用醇降低蛋白的穩(wěn)定性，也可潤濕膜，減少膜帶有的靜

4、電，利于結(jié)合包被。 鹽 通常不會影響 對某些蛋白，兩性離子的鹽類有助于蛋白結(jié)合 減少信號強(qiáng)度，消假陽,18,糖：對包被蛋白的穩(wěn)定性有重要作用，減緩老化速度，也可以增加親水力。 惰性蛋白：對消除假陽有重要作用 表面活性劑：增加親水力，也可增色。,19,緩沖液的基本成分,各種緩沖系: Tris-HCl, PB, CB等 鹽類：NaCl 糖：蔗糖，海藻糖等 表面活性劑：Tween20，Triton x-100等 惰性蛋白：Casein等 防腐劑 ：疊氮鈉，卡松等,20,推薦的起始緩沖液,10mM Phosphate pH 7.0 3% Ethanol,21,“潛水艇” 效應(yīng),表面活性劑處理過的膜在使

5、用時的常見問題 因?yàn)槭褂玫谋砻婊钚詣┦撬苄缘?噴膜時這些表面活性劑被“沖走”了,22,反應(yīng)動力學(xué),流速增加,反應(yīng)速率減低 流速增加,檢測時間縮短 流速增加,靈敏度降低 流速增加,試劑用量增加 流速增加,背景降低 距離增加,流速降低 孔徑增加,蛋白結(jié)合量減少,23,二、和金子墊相關(guān)的配方和原理,和金子墊相關(guān)的工藝和配方有： 1）標(biāo)記工藝； 2）金標(biāo)稀釋液 3）金墊處理液,24,標(biāo)記工藝,膠體金：一般指金的水溶液，又稱金溶膠。 -金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶膠。 其中分散的金顆粒直徑一般在1100nm之間，為負(fù)電荷分布。,25,高質(zhì)量結(jié)合物,單個分散的顆粒 圓形顆粒 很少聚集 這樣得到的

6、膠體穩(wěn)定性 和重復(fù)性好,26,膠體金的生產(chǎn),膠體金的形成是還原HAuCl4. HAuCL4 + e- Au0 還原劑越強(qiáng)，得到的金顆粒越小 生產(chǎn) 40nm診斷用金顆粒一般用檸檬酸三鈉,27,膠體金顆粒的形成,28,膠體金的生產(chǎn),2種重要步驟 直接形成 分步形成 大多數(shù)人用分步形成 比較容易控制顆粒大小，CV也比較小 能夠生產(chǎn)出大顆粒膠體金,29,顆粒大小對膠體的影響,30,蛋白標(biāo)記原理,蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)或稍偏堿的情況下，依靠靜電引力或疏水力或共價鍵，被牢固地吸附于膠體金顆粒表。由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒表面，形成一個蛋白層，從而阻止了膠體金顆粒的相互接觸，使該膠聯(lián)溶液較為穩(wěn)定。,31,要點(diǎn)

7、,蛋白的預(yù)處理 使用低濃度和正確的pH值，確保最小的聚集 合適的蛋白量（可通過鹽滴定進(jìn)行評價） 攪拌速度、容器的潔凈程度、離心的速度,32,鹽滴定,鹽滴定不能衡量蛋白單層的形成 鹽滴定只能代表鹽溶液中多少量的蛋白可以使膠體金穩(wěn)定 pH和時間都會有影響,33,蛋白邦定作用力,電荷作用力（靜電作用力） 疏水力 共價鍵,34,35,金標(biāo)稀釋液,合適的離子種類和強(qiáng)度，0.2M左右，常用有磷酸鹽等。 大分子物質(zhì)作為膠體金干燥后均勻散布的骨架，常用大分子物質(zhì)如PEG4000，PEG20000，PVP 。 小分子物質(zhì)對蛋白活性保護(hù)，蛋白儲存常用的甘油、蔗糖、海藻糖、各類低聚糖等，對產(chǎn)品的儲存穩(wěn)定性有幫助。,

8、36,惰性蛋白，它是保護(hù)目的蛋白的活性，也維持膠體金的膠體穩(wěn)定，它們是消除非特異性的封閉物質(zhì)，也起著有分散膠體金顆粒的骨架作用。常用有BSA 、OVA、Casein。 表面活性劑，具有增加親水性，促進(jìn)結(jié)合等作用。常用的有Tween-20，Tritonx-100。,37,評價金標(biāo)稀釋液的參數(shù),金子釋放程度及速度。 金標(biāo)液穩(wěn)定性。 靈敏度、特異性,38,結(jié)合物釋放墊的原理,什么是結(jié)合物釋放墊? 孔徑開放 快速層析 低蛋白結(jié)合力 理想的親水性 傳統(tǒng)材料是包被PVA的玻纖,39,典型結(jié)合物釋放墊材料的構(gòu)意圖,40,側(cè)向?qū)游鲋薪Y(jié)合物釋放墊的原理,做什么用 (理論上)？ 讓結(jié)合物完好無損的干燥 加樣后讓結(jié)

9、合物快速釋放 實(shí)際應(yīng)用中 側(cè)向?qū)游鲋薪Y(jié)合物釋放墊可能遇到的問題比其它任何組分都多,41,標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合物釋放墊的性能,45秒內(nèi)釋放出約 70% 的結(jié)合物 但是墊上保留的結(jié)合物降低了靈敏度，因?yàn)? 較少的結(jié)合物到達(dá)捕獲線 較少的抗原到達(dá)捕獲線 在側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)中 靈敏度要好 線條CV值一般在 15-20%,42,儲存于 20oC時結(jié)合物釋放率,43,金墊處理液,作用：增加親水性, 促進(jìn)復(fù)溶, 保持穩(wěn)定性 基本成分： 1）緩沖系統(tǒng)：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物緩沖液等。 2）表面活性劑：Tween-20，Tritonx-100等。 3）大分子物質(zhì)：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA 4）

10、惰性蛋白：BSA 、OVA、Casein。 5）小分子保護(hù)物質(zhì)：糖類物質(zhì)，如蔗糖，海藻糖等。,44,結(jié)合物釋放常見問題,釋放不充分 釋放慢 釋放墊再次濕潤困難,45,釋放不充分,結(jié)合物綁定到釋放墊上了 用聚合物和表面活性劑封閉釋放墊 在儲存過程中，結(jié)合物發(fā)生聚集 控制封閉劑的用量 控制溶液的離子強(qiáng)度,46,釋放慢,您的釋放墊是怎樣封閉的? 是否加了親水試劑？ 是否用了大量的蛋白? 是否用了大量的糖? 試紙條各組分之間接觸緊密么?,47,釋放墊再次濕潤困難,您使用的是哪一種釋放墊? 是親水的么? 您是怎樣封閉釋放墊的?,48,三、和樣品墊相關(guān)的配方和原理,作用：改變樣本PH, 調(diào)節(jié)爬速, 控制金

11、標(biāo)釋放，抑制非特異性吸附,降低背景 基本成分： 1）緩沖系統(tǒng)：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物緩沖液等。 2）表面活性劑：Tween-20，Tritonx-100等。 3）大分子聚合物質(zhì)：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA 4）惰性蛋白：BSA 、OVA、Casein。 5）生物物質(zhì)：鼠IGg，抗紅細(xì)胞抗體等。,49,血清類樣品墊 注意爬速，背景，靈敏度的達(dá)到和假陽的消除。 全血類樣品墊 1）必須能夠去除紅細(xì)胞！ 2）還需具備下列功能 不能造成溶血 不能干擾樣品 分離必須快速高效 必須能夠分離一定范圍內(nèi)的不同血樣量 靈敏度的達(dá)到和假陽的消除,50,尿液類樣品墊 注意交叉反應(yīng)的消除

12、。,51,影響抗原抗體反應(yīng)的外部因素,電解質(zhì) 抗原與抗體發(fā)生結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體的過程中須有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，水化層破壞，復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊的凝集或沉淀。若無電解質(zhì)參加，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用O.85氯化鈉或各種緩沖液作抗原及抗體的稀釋液及反應(yīng)液。但電解質(zhì)的濃度不宜過高，否則會出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。,52,酸堿度 蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點(diǎn)?？乖贵w反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行，pH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)。抗原抗體反應(yīng)一般在pH為69進(jìn)行。,53,溫度 抗原抗體反應(yīng)必須在合適

13、的溫度中進(jìn)行，一般以1540為宜，最適反應(yīng)溫度為37。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)，對溫度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。,54,反應(yīng)時間 反應(yīng)時間越長，抗原抗體反應(yīng)越充分，顯色也越深。 所有調(diào)整輔料的思路都可從抗原抗體反應(yīng)的影響因素和輔料的成分性質(zhì)進(jìn)行考慮和設(shè)計(jì)。,55,四、相關(guān)問題,假陽問題 假陰問題 穩(wěn)定性問題 上樣問題,56,（一）假陽問題,未標(biāo)記上的金顆粒（裸金） 電荷作用 疏水作用 硫醇類物質(zhì)的存在（S-H鍵起作用） 抗原抗體作用（內(nèi)源性物質(zhì)） 抗凝劑和防腐劑的影響 其他原因,57,未標(biāo)記上的金顆粒（裸金）,裸金聚集，周圍具有大量的負(fù)電荷，當(dāng)樣本

14、爬過金墊，裸金隨著向上跑，在T線位置只要碰到帶有正電荷的蛋白，即發(fā)生反應(yīng)，形成假陽線條。 解決方法：檢查標(biāo)記過程，BSA封閉,58,電荷作用,膠體金顆粒帶有負(fù)電荷，當(dāng)遇上帶有正電荷的蛋白，易發(fā)生非特異性結(jié)合反應(yīng)，導(dǎo)致假陽。反應(yīng)環(huán)境為酸性時，已發(fā)生此類結(jié)合。 解決方法：改變pH和鹽度,59,疏水作用,抗原抗體結(jié)合以及和膠體金結(jié)合都需要用到疏水作用力，當(dāng)反應(yīng)環(huán)境中存在疏水物質(zhì)時，易和膠體金或抗原抗體通過疏水作用力結(jié)合，產(chǎn)生假陽結(jié)果，如標(biāo)本里的一些脂肪，細(xì)胞碎片，細(xì)菌等等。 解決方法：用表面活性劑或親水聚合物進(jìn)行處理。,60,抗原抗體作用,此類作用是指標(biāo)本里面含有能和標(biāo)記材料/包被材料發(fā)生免疫反應(yīng)的

15、非目標(biāo)物的其他物質(zhì)導(dǎo)致的假陽結(jié)果。 常見的有毒品的交叉反應(yīng)，如KET試劑檢測美沙酮標(biāo)本，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，就是美沙酮和KET材料發(fā)生了交叉反應(yīng)；又有SG試劑中的抗鼠抗體反應(yīng)等等。 解決方法：在樣品墊或金子墊或硝酸纖維素膜上加入相應(yīng)的抗體，將這類物質(zhì)在T線前消除掉。,61,在血清檢測中的具體非特異性反應(yīng)物質(zhì),大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等。,62,類風(fēng)濕因子 人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記

16、二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性。 解決該情況的辦法是：(1)用F(ab)2替代完整的IgG；(2)標(biāo)本用預(yù)先熱變性(63，10min)IgG的固相吸附劑處理(將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效)；(3)檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。,63,補(bǔ)體 如果在包被和標(biāo)記過程中，使用的抗體的FC段的補(bǔ)體Clq分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，從而易使Clq可以將補(bǔ)體和抗體二者連接起來，造成假陽性現(xiàn)象。 解決的方法是：(1)用EDTA稀釋標(biāo)本；(2)用53、10min加熱血清使Clq滅活。,64,嗜異性抗體 人類血清中含有能與嚙齒類動物(如鼠等)Ig(s)結(jié)合的天然嗜異

17、性抗體，易和包被和標(biāo)記的抗體產(chǎn)生反應(yīng)，能造成假陽性。 解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig(s)，但加入量不足或亞類不同時無效。,65,醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體（嗜異性抗體的一種） 臨床開展的用鼠源性CD3等克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig(s)抗體。 解決的方法是：測定抗原時，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig(s)，從而克服由于上述原因造成的假陽性。,66,例子：Sg采用了雙抗體夾心的方法進(jìn)行檢測，包被材料和標(biāo)記材料都是單克隆抗體，屬于鼠IGg類別，由

18、于人體經(jīng)常和動物打交道，體內(nèi)易產(chǎn)生嗜異性抗體，如抗鼠抗體，抗?？贵w等等，這類嗜異性抗體極易導(dǎo)致假陽反應(yīng)的產(chǎn)生。,67,為了消除嗜異性抗體的影響，可通過在樣品墊中加入正常的動物血清或純化的鼠IGg，又或者在膜上噴有鼠IGg A線，金子中加有正常的動物血清或純化的鼠IGg等等方式將嗜異性抗體排斥在T線前，消除這方面的假陽。,68,嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結(jié)果。 解決的辦法是：測定前需用理化方法將其解離后再測定。,69,交叉反應(yīng)物質(zhì) 類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測定抗原時，如果交叉抗原測定簇正好是所用單克隆抗體相對的靶決定簇時，也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。,70,抗凝劑和防腐劑的影響,抗凝劑(如肝素、EDTA、枸櫞酸鈉)，防腐劑(如NaN3)因?yàn)閷﹄x子和蛋白活性的影