1、實(shí)驗(yàn)八 微生物的分離純化及平板計(jì)數(shù),1掌握倒平板的方法和幾種分離純化微生物的基本操作技術(shù)。2學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法,一、目的要求,實(shí)驗(yàn)原理,1.從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。 本實(shí)驗(yàn)采用平板分離法： 1)選擇合適的選擇培養(yǎng)基。 2)通過稀釋倒平板和平板劃線等技術(shù)得到單 個(gè)菌落。 2.平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，取一定量的稀釋液接種在平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，平板上出現(xiàn)單個(gè)菌落，即為一個(gè)菌落形成單位（colony-forming units,cfu） 。,吸取稀釋液取一吸管，以無菌操作法分別吸取105、106、 107土壤稀釋液0

2、.1mL，加在已制好的平板培養(yǎng)基上。 涂板用玻璃刮刀將稀釋液在培養(yǎng)基上充分混勻鋪平，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。 計(jì)算出每克土壤中細(xì)菌的數(shù)量。即用某一培養(yǎng)皿內(nèi)的菌落數(shù)乘以該培養(yǎng)皿接種液的稀釋倍數(shù)即得。 挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行劃線分離。,微生物的分離平板涂布法,微生物的分離平板傾注法,吸取稀釋液取一吸管，以無菌操作法分別吸取104、105 、 106土壤稀釋液0.5-1mL，加在空培養(yǎng)皿中。 混和搖勻水平輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液、培養(yǎng)基充分混勻鋪平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 計(jì)算出每克土壤中放線菌的數(shù)量。 挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行劃線分離。,微生物的分離平板劃線法,制成平板。 凝固后，用接種環(huán)取

3、相應(yīng)的菌液一環(huán)（101）在平板上劃線。1.連續(xù)劃線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面作連續(xù)劃線。完畢后，倒置于28300C溫室培養(yǎng)。2.分區(qū)劃線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤稀釋液1環(huán)，先在培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線34條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次劃線會(huì)，同法依次作第三次和第四次劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。 挑取單個(gè)菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，如果不純，再移植純化，最后得到純培養(yǎng)。,實(shí)驗(yàn)材料,樣品：新鮮土壤。 培養(yǎng)基：滅菌的淀粉瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 無菌水：帶有玻璃珠裝有99mL無菌水三角瓶、裝有4.5mL

4、無菌水的試管。 其它：無菌培養(yǎng)皿、無菌吸管、無菌三角玻棒、電子天平、記號(hào)筆、接種環(huán)、酒精燈、火柴。,實(shí)驗(yàn)步驟,1制備土壤稀釋液 稱取土樣1g，放入盛有99ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖混勻。 210倍梯度稀釋 用無菌吸管吸取上述土壤稀釋液0.5ml加入盛有4.5ml無菌水的試管中充分混勻，然后再用無菌吸管從此試管中吸取0.5ml加入盛有4.5ml無菌水的另一支試管中充分混勻，以次類推制成10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的溶液。,一、土壤中細(xì)菌的分離、純化及菌落計(jì)數(shù)（6皿/組）,3涂布 選擇3個(gè)連續(xù)梯度（10-4、10-5、10-6），每個(gè)稀釋度涂布2個(gè)平板，涂布時(shí)用無

5、菌吸管每個(gè)平板滴加0.1mL，用無菌玻棒涂布均勻。 4培養(yǎng) 37倒置培養(yǎng)過夜。 5計(jì)數(shù)并檢驗(yàn)產(chǎn)胞外淀粉酶的菌株 總菌落計(jì)數(shù)完后，將平板內(nèi)滴加1-2ml盧戈氏碘液，菌落周圍產(chǎn)生透明圈的菌落就是產(chǎn)胞外淀粉酶的菌株，觀察并計(jì)數(shù),二、劃線分離,平板的制作（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基） 將15ml培養(yǎng)基無菌條件下倒平板，待其凝固后備用（4皿/組） 劃線分離： 取枯草桿菌和金黃色葡萄球菌混合菌懸液一環(huán)，采用連續(xù)劃線或分區(qū)劃線的方法分離單菌落,（1）計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)有較大片菌苔生長(zhǎng)時(shí)，棄用；以無片菌苔生長(zhǎng)的平皿計(jì)數(shù)。若片菌苔大小不到培養(yǎng)皿的一半，其余一半分布均勻，將此一半計(jì)數(shù)2（2）選擇平均菌落數(shù)在303

6、00之間的平板只有一個(gè)符合此范圍時(shí)，以該平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)。有兩個(gè)在30300間時(shí)，按兩者菌落總數(shù)比值決定：比值小于2，取平均；比值大于2，取較小的菌落總數(shù)。（3）所有菌落數(shù)均大于300，取稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)。（4） 所有菌落數(shù)均小于30，取稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)。（5） 所有菌落數(shù)均不在30300之間，以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)。,菌落計(jì)數(shù)方法 p207,實(shí)驗(yàn)報(bào)告,計(jì)算土壤樣品的細(xì)菌總數(shù)和產(chǎn)胞外淀粉酶的菌落數(shù) 觀察混合菌懸液的劃線分離情況，并描述兩種菌的菌落形態(tài)特征,思 考 題,1、如何確定平板上某單個(gè)菌落是否為純培養(yǎng)物？請(qǐng)寫出實(shí)驗(yàn)的主要步驟。P74 (1) 2、如果一項(xiàng)科學(xué)研究?jī)?nèi)容需從自然界中篩選到能產(chǎn)高溫蛋白酶的菌株，你將如何完成？請(qǐng)寫出簡(jiǎn)明實(shí)驗(yàn)方案。P74(4),上次實(shí)驗(yàn)習(xí)題解答,1、為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行效正？P48 (1) 進(jìn)行顯微測(cè)量時(shí)，主要是利用效正后的目鏡測(cè)微尺對(duì)物象進(jìn)行測(cè)量。而物鏡或目鏡的實(shí)際放大倍數(shù)與標(biāo)注的可能有誤差，因此，更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行效正。,2、某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)1-2中可行的檢測(cè)方法。 首先將干酵母粉稀釋成一定的濃度，用