1、第四章 酶分子的修飾,第二節(jié) 酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用 一、酶的表面化學(xué)修飾 （一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾） 是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。 1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。,2. 修飾劑： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價結(jié)合。,3. 應(yīng)用： 如：PEG超氧化物歧化酶（SOD） PEG溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等） PEG天門冬酰胺酶（ASNase） 消除了抗原性 延長了酶在體內(nèi)的半衰期 又如：用D

2、extran 右旋糖酐 修飾-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、過氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。,（二）小分子修飾 （酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾） 1 概念 定義：通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。 側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。 20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。,根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類。 非極性R基氨基酸（共8種）： 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 纈

3、氨酸(Valine,Val,V), 異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P), 無電荷的極性R基氨基酸（共7種）： 絲氨酸(Serine,Ser,S), 蘇氨酸(Threonine,Thr,T), 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C), 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,

4、Q) 帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）： 賴氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R), 組氨酸(Histidine,His,H) 帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）： 天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E),小分子修飾的幾種重要反應(yīng)： 烷基化反應(yīng) 酰化反應(yīng) 氧化還原反應(yīng) 芳香環(huán)取代反應(yīng),2 修飾反應(yīng) 1) 烷基化反應(yīng) 試劑特點：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如NH2，-SH等）發(fā)生烷基化。 可作用基團(tuán)： 氨基（Lys賴，Arg精），巰基（Cys半光），羧基（Asp天冬、Glu谷），甲硫

5、基（Met甲硫），咪唑基（His組）。 修飾劑：2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。,烷基化反應(yīng),2) ?；磻?yīng) 試劑特點：含有 結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的 親核基團(tuán)，使之酰基化。 可作用基團(tuán)： 氨基，巰基，醇羥基（Ser絲、Thr蘇），酚羥基（Tyr絡(luò)）,?；磻?yīng),3) 氧化還原反應(yīng) 試劑特點：具有氧化或還原性。 氧化劑：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亞胺 可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。 還原劑：2巰基乙醇、DTT等。 可被還原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。,連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。,4) 芳香環(huán)取代反應(yīng) 試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。 碘

6、代： I2 + HI 硝化： (NO2)4C + +(NO2)3CH,（四硝基甲烷）,3 特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾 1) 氨基的化學(xué)修飾： 來源：Lys賴, Arg精, His組, Gln谷 修飾反應(yīng)：?；c烷基化 酰基化修飾劑: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS） 烷基化修飾劑： 2，4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等,2，4二硝基氟苯,碘乙酸,三硝基苯磺酸,2) 羧基的化學(xué)修飾 修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。 常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。 可定量測定酶分子中羧基的數(shù)目。 + ,水溶性碳化二亞胺,3)胍基的化學(xué)修飾 來源：Arg 精 修飾反應(yīng)：

7、本質(zhì)上是羰Tang =co基對氨基酰基化。 修飾劑： 丁二酮 二羰基化合物 1，2環(huán)己二酮 苯乙二醛,4)巰基的化學(xué)修飾 來源：Cys半光 修飾反應(yīng):烷基化 修飾劑：碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM) E-SH + R-X E-SR +HX N-乙基馬來酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑） ESH ,5) 二硫鍵的化學(xué)修飾 還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）,氧化：過甲酸:,6)咪唑基的化學(xué)修飾 來源：His組 修飾反應(yīng):酰基化與烷基化 ?；揎梽? 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate） + + C2H5OH +CO2 烷基化修飾劑：碘乙酸,7）酚羥基的化

8、學(xué)修飾 來源：Tyr酪 修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng) 修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）,8）吲哚基的化學(xué)修飾 來源：Trp色 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng) 修飾劑： N-溴代琥珀酰亞胺,各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑,但解釋修飾效果須十分小心，因為： 任何一種修飾劑不是絕對專一的。 有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化失活， 不一定是活性中心基團(tuán)被共價修飾。 不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。,（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法） 用雙功能基團(tuán)試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。 （四）固定化修飾（共價偶聯(lián)法） 通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。,二、酶分子內(nèi)部修飾 （一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾） 蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。 （與前面化學(xué)修飾區(qū)別）,酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種： 1 引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。 2 仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。 3 有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。 后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。,應(yīng)用實例： 1）提高酶活力： 2）消除抗原性：,（二）氨基酸置換修飾 將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，