1、,核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段。 優(yōu)點(diǎn)： （1）便于分離; （2）便于檢測(cè); （3）便于回收。,第四節(jié) 核酸樣品的分析與檢測(cè),一、核酸樣品的凝膠電泳分析 (一)凝膠電泳檢測(cè)核酸的基本原理 核酸分子在中性或偏堿性的緩沖系統(tǒng)中帶負(fù)電，在電泳過程中，核酸分子從負(fù)極向正極移動(dòng)，并按核酸構(gòu)型和分子大小分離開。電泳后用染料染色。 由于在電泳中往往使用無(wú)反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，電泳遷移率（或遷移速度）與分子的摩擦系數(shù)成反比。而摩擦系數(shù)是分子大小、介質(zhì)粘度等的函數(shù)。 因此，可在同一凝膠中、一定電腸強(qiáng)度下、可在凝膠上分離出不同分子量大小或相同分子量但構(gòu)型有差異的核

2、酸分子。 瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳,（二）瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取來(lái)的，為一種聚合線性分子，一般含有多糖、蛋白質(zhì)和鹽等雜質(zhì)，雜質(zhì)的含量每個(gè)廠商和批號(hào)的產(chǎn)品不盡相同。對(duì)DNA電泳遷移率的影響也不一樣，經(jīng)化學(xué)修飾后熔點(diǎn)降低的瓊脂糖叫低熔點(diǎn)瓊脂糖，其機(jī)械強(qiáng)度無(wú)明顯變化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10500 bp）的分離。瓊脂糖凝膠的孔徑取決于瓊脂糖的濃度。,瓊脂糖可以形成各種形狀、大小的孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒

3、定的電場(chǎng)下電泳。,(1)凝膠緩沖液和電泳緩沖液 TBE,TAE TAE的緩沖容量最低，如長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)被消耗，此時(shí)凝膠的陽(yáng)極一側(cè)將發(fā)生酸性化； TBE比TAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量。 雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE中遷移快10%。 對(duì)于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，對(duì)于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化

4、或DNA變性。,不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍,(3)加DNA樣品 載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。 載樣緩沖液有三個(gè)作用： 1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)； 2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過程； 3）其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。,(4)凝膠電泳的標(biāo)準(zhǔn)DNA (5)電泳條件 (6)溴化乙錠染色和紫外觀察 通過染色, 紫外燈下檢測(cè)。 主要有溴化乙錠（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。,EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì) EB可用來(lái)檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸,當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無(wú)EB

5、情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。,2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp,SYBR Gold是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強(qiáng)熒光信號(hào)。,可以用透射或入射紫外光對(duì)EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。,（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳,在TEMED (四甲基乙二胺) 催化過硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長(zhǎng)鏈。 在雙功能交聯(lián)劑如N，N-亞甲雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。 網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度

6、。,CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亞甲雙丙烯酰胺）,1 變性聚丙烯酰胺凝膠 用于單鏈DNA片段的分離或純化。 變性的DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無(wú)關(guān)。 用途：放射性DNA探針的分離、DNA測(cè)序反應(yīng)等。,2 非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于雙鏈DNA片段的分離和純化。 注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。 用途：制備高純度的DNA片段。,DNA在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍,注:N,N-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/30;,（四） 脈沖場(chǎng)凝膠電泳pulsed-field gel elec

7、trophoresis PFGE,為何選PFGE？ 超過一定大小的線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長(zhǎng)度（40kb）后DNA的遷移速率幾乎與分子大小無(wú)關(guān)，而主要決定于電場(chǎng)強(qiáng)度。但 PEGE 解決了這一問題。,PFGE 工作的基本原理 這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行的。DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間取決于它的大小。 該法可分離長(zhǎng)至5Mb的DNA分子。嚴(yán)格說來(lái)，應(yīng)叫交替電場(chǎng)凝膠電泳。,脈沖電場(chǎng)電泳示意圖,垂直脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)(vertical pulsed field) 場(chǎng)翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)(field inversion) 旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)(rotatin

8、g gel) 鉗位均勻電場(chǎng)系統(tǒng)(contour-clamped homogeneous electric field),（五）變性凝膠電泳,RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行。非變性電泳使用1.0%-1.4%的凝膠，不同的RNA條帶也能分開，但無(wú)法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下，RNA的泳動(dòng)率才與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測(cè)定RNA分子量時(shí)，一定要用變性凝膠。在需快速檢測(cè)所抽提的總RNA樣品完整性時(shí)，配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可。,總RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,RNA電泳圖,DNA變性凝膠電泳主要用于檢測(cè)DNA分子中的堿基組成的變異。電泳過程中當(dāng)雙鏈DNA分子處于變性條件時(shí)，解離成單鏈，在有變性劑的凝膠中泳動(dòng)速度發(fā)生變化，最終停下在特定的位置，堿基組成不同則停在不同的位置。,該方法是將PCR擴(kuò)增的