1、免疫學(xué)檢驗,吳倩 講師 衛(wèi)生檢驗系 公共衛(wèi)生學(xué)院 南京醫(yī)科大學(xué)13921433351 ,第一節(jié)酶免疫技術(shù)的原理 第二節(jié) 酶免疫技術(shù)的分類 第三節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附試驗 第四節(jié) 固相酶免疫測定的技術(shù)要點 第五節(jié) 酶免疫組織化學(xué)技術(shù) 第六節(jié) 其他酶免疫技術(shù) 第七節(jié) 酶免疫測定的應(yīng)用,第八章 酶免疫技術(shù),第一節(jié) 酶免疫技術(shù)的原理,主要試劑: 酶標記的抗體或抗原 酶標物特點： 免疫學(xué)活性 酶對底物的催化活性,抗原抗體反應(yīng)的特異性,+,酶促催化反應(yīng)的高敏感性,原理及特點,特點： 靈敏度高、特異性強、準確性好 酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定 操作簡便、對環(huán)境沒有污染。 易與其它技術(shù)

2、偶聯(lián) 衍生出適用范圍更廣的新方法。,原理： 酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng) 酶對底物的顯色反應(yīng) 對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析,原理及特點,第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類,酶免疫技術(shù),酶免疫組化,酶免疫測定,均 相,異相,固相酶免疫測定,液相酶免疫測定,組織切片中的抗原抗體反應(yīng),液體標本中抗原或 抗體的定性和定量,(ELISA),用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定,酶標記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。 Ag+Ab-E Ag-Ab-E+?,原理,一、均相酶免疫測定,最具代表性的

3、兩種技術(shù),酶放大免疫測定技術(shù)EMIT enzyme-mutiplied immunoassay technique,克隆酶供體免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor immunoassay,均相酶免疫測定,EMIT示意圖,CEDIA示意圖,分類：液相酶免疫測定 固相酶免疫測定 以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 是目前最為常用的固相酶免疫測定,與均相不同之處,需分離游離與結(jié)合的酶標記物,二、異相酶免疫測定,第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗,三個部分： 免疫反應(yīng) 酶與底物反應(yīng) 檢測方法的建立,ELISA,酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immu

4、nosorbent assay, ELISA ）,高純度的抗原、高親和力的抗體 高活性、高純度的標記用酶 有效的交聯(lián)方法制備高質(zhì)量的酶標記物 選用適宜的酶/底物系統(tǒng) 分離結(jié)合與游離標記物的方法 建立操作步驟以及研究自動化測定技術(shù),底物顯色 定性或定量的分析,原理,包被,反應(yīng) 加入待測抗體或 抗原和酶標抗原 或抗體,洗滌 使結(jié)合在固相上 的抗原抗體復(fù)合物 與未結(jié)合的分離,1,2,3,4,一、基本原理,固相的抗原或抗體,酶標記物,酶反應(yīng)的底物,三個必要試劑,二、方法類型及反應(yīng)原理,雙抗體夾心法（double antibody sandwich-ELISA） 方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加

5、酶標抗體，加底物顯色 應(yīng)用： 二價或二價以上的較大分子抗原測定(乙型肝炎表面抗原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的測定。,ELISA檢測抗原的方法,1、已知抗體包 被于載體表面,3、加酶標抗體 與抗原結(jié)合,4、加酶作用的底物 產(chǎn)生顏色,2、加待檢物 抗原與抗體結(jié)合,4、加酶作用的底物 不產(chǎn)生顏色,雙抗體夾心法測抗原,1、已知抗體包 被于載體表面,2、加待檢物無抗 原與抗體結(jié)合,3、加酶標抗體 無抗原結(jié)合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,ELISA檢測抗體的方法,捕獲法 原理： 抗人IgM鏈抗體包被 捕獲待測標本中IgM類抗體 加入特異性抗

6、原和酶標記特異性抗原的抗體 底物顯色,應(yīng)用： 病原體急性感染診斷中的IgM型抗體 甲型肝炎HAV-IgM抗體 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體,捕獲法原理,+,-,1、固相化抗人 IgM,1、固相化抗人 IgM,2、加待測物 特異性IgM與 非特異性IgM 和抗人IgM結(jié)合,3、加特異性 抗原，與特異 性抗體結(jié)合,4、加酶標抗體 與特異性抗原結(jié) 合，加底物顯色,2、加待測物 只有非特異性IgM 和抗人IgM結(jié)合,3、加特異性抗 原，不能與非 特異性IgM結(jié)合,4、加酶標抗體 無抗原結(jié)合， 加底物不顯色,第四節(jié) 固相酶免疫測定的技術(shù)要點,試劑的準備 反應(yīng)條件的選擇 操作的標準化,一、試劑的準備

7、,（一）固相載體 聚苯乙烯 特點：吸附蛋白能力強，保留其免疫活性 形狀：小試管、小珠、微量ELISA板 使用前檢測其性能 （二）抗原和抗體 高純度的Ag 高效價的Ab,一、試劑的準備,（三）酶和底物的選擇 標記酶的要求： 活性高 性質(zhì)穩(wěn)定 專一性強 酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量 方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉,辣根過氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶） 亞鐵血紅素（輔基） 主酶與酶活性無關(guān) 輔基是酶的活性中心,RZ值：403nm （輔基）與275nm（主酶） OD值之比,RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要,ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標記用酶,常

8、用酶,HRP的底物,DH2+H2O2 D+2H2O,HRP,供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種,H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高（小分子醇和尿素的過氧化物）,常用底物,HRP的常見底物,鄰苯二胺 OPD,四甲基聯(lián)苯胺 TMB,5-氨基水楊酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 ABTS,常用底物,OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。,TMB反應(yīng)后顯藍色 ，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm ，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。,HRP的常見底物,堿性磷酸酶（ALP）,菌源性ALP 腸

9、粘膜ALP(小牛),半乳糖苷酶（-Gal）,常用酶,大腸埃希氏菌,ALP的 底物,-Gal 的底物,對-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,4-甲基傘酮基-D半-乳糖苷（ 4MUG ）,經(jīng)ALP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405 nm。,酶作用后，生成高強度熒光物 ，用熒光計 測量。,常用底物,二、酶標記抗體或抗原的方法,酶免疫技術(shù)的核心組成部分,酶結(jié)合物（conjugate） 酶標記物,通過化學(xué)反應(yīng)或免 疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與 抗體或抗原形成的 結(jié)合物,抗原要求純度高，抗原性完整,抗體需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。,制備方法要求,制備方法,過碘酸鈉法（

10、直接法） 常用于HRP標記抗體或抗原,戊二醛交聯(lián)法,戊二醛交聯(lián)法,戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質(zhì)量較均一。,純化,標記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度,常用的純化方法： 葡聚糖凝膠（Sephadex）G-200/G-150過柱層析純化 50%飽和硫酸銨沉淀提純 親和層析效果更好（SPA-IgG;ConA-HRP）,二、酶標記物的純化和鑒定,鑒定,質(zhì)量鑒定（ELISA法直接測定）,H

11、RP標記IgG的酶標記率（戊二醛法） 酶結(jié)合量（mg/ml） IgG量（mg/ml） HRP/ IgG摩爾比 酶的標記率,四、最適工作濃度的選擇(棋盤法),五、測定方法的標準化,包被 加樣 洗滌 孵育 結(jié)果判定,理想coating：吸附盡可能多的Ag或Ab；吸附牢固；非特異性吸附較少 包被機制 1、物理性吸附（被動的） 2、共價交聯(lián)（戊二醛，標準化） 影響包被的因素 1、包被物質(zhì)的性質(zhì)及其濃度 2、包被緩沖溶液的pH及離子強度 3、包被溫度和時間,包被物質(zhì)的性質(zhì)及其濃度 聚苯乙烯吸附抗原效果好 聚乙烯吸附抗體效果好 濃度過高引起前帶現(xiàn)象 濃度過低引起非特異性吸附(BSA封閉) 包被緩沖溶液的p

12、H及離子強度 相對低的離子強度有利于蛋白質(zhì)分子吸附固相表面 包被溫度和時間 置4冰箱過夜，或37 孵育2h,加樣 加樣量準確 加樣位置 不產(chǎn)生氣泡,洗滌 目的 1、洗去未結(jié)合的物質(zhì) 2、洗去非特異性吸附 要求 1、每孔充滿液體 2、去凈洗滌液（Tween20） 3、沖洗次數(shù)和浸泡時間足夠 4、具有傳染性樣品必須采用全自動沖洗,孵育 定義：要使抗原抗體反應(yīng)和酶催化反應(yīng)順利進行，需要合適的pH和適當離子強度的基質(zhì)液，保持一定的溫度，并作用一定時間，整個過程稱為孵育或溫育。 方法：干式 濕氏 推薦溫度：37 增強作用:聚乙二醇 反應(yīng)時間:以陽性標本的吸光度值達到1.0時為反應(yīng)終點,結(jié)果判定 1、吸光

13、度法（A） 2、比例法(A/A0) 3、滴度法（倍比稀釋樣品） 4、吸光度直接表示陽性的程度（均一化） 5、標準曲線法,第五節(jié) 酶免疫組織化學(xué)技術(shù),酶免疫組織化學(xué)技術(shù)(enzyme immunohistochemistry technique),定義 在一定條件下，應(yīng)用酶標抗體或抗原與細胞或普通組織切片中抗原或抗體反應(yīng)，酶與底物作用形成有色沉淀物或產(chǎn)物電子密度發(fā)生改變，在光鏡和電鏡下，就可識別出標本中抗原或抗體的分布和性質(zhì)；經(jīng)圖像分析也可達到定量的目的。 種類 1、標記抗體免疫組織化學(xué)技術(shù) 2、非標記抗體酶免疫組織化學(xué)技術(shù) 3、酶標記免疫電鏡技術(shù),1、標記抗體免疫組織化學(xué)技術(shù),第六節(jié) 其他酶免

14、疫技術(shù),免疫印記法（immunoblotting test）,其他酶免疫技術(shù),生物素-親和素（BSA）-酶聯(lián)免疫吸附試驗 生物素（biotin）-親和素（avidin） 親和素與生物素之間的親和力極強，比抗原與抗體的親和力至少高1萬倍，且具有高度特異性和穩(wěn)定性。,其他酶免疫技術(shù),第七節(jié) 酶免疫測定的應(yīng)用,ELISA在預(yù)防醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用 病原體及其抗體的檢測（乙肝兩對半） 蛋白質(zhì)的檢測 非肽類激素的檢測 藥物的檢測 尿中毒品的檢測,酶免疫測定的應(yīng)用,ELISA在食品檢測中的應(yīng)用 食品中微生物的檢測 食品毒素的檢測（黃曲霉毒素） 食品中殘留農(nóng)藥的檢測（除草劑、殺菌劑和殺蟲劑） 食品中殘留抗生素的檢測（氯霉素、磺胺類、呋喃類、喹諾酮類）,酶免疫測定的應(yīng)用,ELISA在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用（PCR-ELISA方法） DNA檢測 蛋白質(zhì)檢測,酶免疫測定的應(yīng)用,1酶免疫技術(shù)的要點？ 2酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理（ELISA）？ 3競爭法在酶聯(lián)免疫檢測應(yīng)用中的原理和應(yīng)用？ 4常用的底物有哪幾類？特點？ 5常用的酶有哪幾類？特點？ 6何謂包被與封閉？其作用？ 7對酶免疫技術(shù)的應(yīng)用評價如何？,思考題,酶免疫技術(shù)是標記免疫技術(shù)的一種，它是以酶標記的抗原或抗體作為主要試劑的免疫檢測