1、細(xì)胞因子的檢測方法,1,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)胞因子,一類由細(xì)胞分泌，具有多種功能的高活性小分子蛋白，參與免疫調(diào)節(jié)和多種生理病理過程等。 白細(xì)胞介素(interleukin, IL) 干擾素(interferon, IFN) 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF) 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) 生長因子(growth factor, GF) 趨化因子(chemokine),2,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)胞因子的檢測方法,3,PPT學(xué)習(xí)交流,待檢樣品(細(xì)胞上清) 指示細(xì)胞（CTLL-2） IL-2依賴細(xì)胞系,按不同稀釋度加入,37

2、C，16-20小時(shí),加入3HTdR（1-5Ci）,37C，4-6小時(shí),收集細(xì)胞,測定,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),4,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn),待檢樣品（細(xì)胞上清） IFN-指示細(xì)胞（wish）,按不同稀釋度加入,37C，4小時(shí),37C，24-48小時(shí),棄取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒),觀察細(xì)胞病變（鏡檢或比色）,5,PPT學(xué)習(xí)交流,Using CFSE to track CML progenitor proliferation,SDM,SDM + Glivec,6,PPT學(xué)習(xí)交流,Calculation of Proliferative Index (P.I.),CFSE -,4 3 2 1

3、 0,The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells. It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments.,7,PPT學(xué)習(xí)交流,Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colo

4、rimetric),8,PPT學(xué)習(xí)交流,Chromium-51 (51Cr) release assays,9,PPT學(xué)習(xí)交流,計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞,趨化因子,細(xì)胞,趨化實(shí)驗(yàn)示意圖,微孔濾膜,10,PPT學(xué)習(xí)交流,用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，使微量的、不可見的反應(yīng)成為可見的或可測定的。,免疫標(biāo)記技術(shù),11,PPT學(xué)習(xí)交流,高通量細(xì)胞因子檢測 CBA (Cytometric Bead Array)是一種微珠多用途檢測分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液、EDTA血漿、血清樣本中被檢測物質(zhì)的量。其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISA分析技術(shù)相

5、比，此方法可以同時(shí)檢測多項(xiàng)指標(biāo)。用已知的標(biāo)準(zhǔn)品和對照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出被測樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而且可以得到一個(gè)樣本的多個(gè)數(shù)據(jù)。,12,PPT學(xué)習(xí)交流,Cytokine network,13,PPT學(xué)習(xí)交流,14,PPT學(xué)習(xí)交流,15,PPT學(xué)習(xí)交流,CBA原理示意圖,16,PPT學(xué)習(xí)交流,17,PPT學(xué)習(xí)交流,Lab Invest 2003, 83:11311146,cytokine bead arrays(CBA),18,PPT學(xué)習(xí)交流,ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)),ELISPOT技術(shù)利用結(jié)合在固相載體上的抗細(xì)胞因子的特異性抗體，在分泌細(xì)胞周圍直接撲獲待檢細(xì)胞因子。

6、實(shí)驗(yàn)中每個(gè)斑點(diǎn)（spot）是激活的淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子區(qū)域，代表一個(gè)活性淋巴細(xì)胞。它可在單細(xì)胞水平檢測淋巴細(xì)胞對特異性抗原的反應(yīng)能力。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，是目前為止最靈敏的檢測技術(shù)?？蓹z測到百萬分之一陽性細(xì)胞率; 單細(xì)胞水平、活細(xì)胞功能檢測; 操作簡便，可進(jìn)行高通量篩選。,19,PPT學(xué)習(xí)交流,1.特異性單抗包被在培養(yǎng)板孔底部； 2.封閉能結(jié)合單抗的其他部位；,3.加入細(xì)胞及刺激物培養(yǎng)，陽性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被單抗捕獲；,4.移出細(xì)胞，洗滌；,5.加入生物素標(biāo)記的二抗；,6.加入酶標(biāo)鏈霉親和素；,7.加入顯色底物，在酶的催化分解下，產(chǎn)生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點(diǎn)；,8.斑點(diǎn)計(jì)數(shù)

7、（可人工計(jì)數(shù)，也可用自動(dòng)讀板儀計(jì)數(shù)），數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。,ELISPOT,20,PPT學(xué)習(xí)交流,21,PPT學(xué)習(xí)交流,應(yīng) 用,移植研究-allograft rejection 疫苗開發(fā)-亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響 Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析 自體免疫研究-免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究 癌癥研究-腫瘤反應(yīng)T細(xì)胞作用 過敏機(jī)制探討-IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機(jī)制之細(xì)胞因子的研究 傳染疾病研究-Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, mul

8、tiple sclerosis, 等,22,PPT學(xué)習(xí)交流,Medium,PHA,Peptide 1,Peptide 21,Peptide 47,GzB,HIV- peptide recall patient B,IFN- g,HIV-peptide specific recall response shows dissociated production of IFN- g and GzB,Kleen T. et al, AIDS 2003, 18: 383-392,23,PPT學(xué)習(xí)交流,ELISPOT 和 ELISA的區(qū)別,ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，

9、是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展，它們最大的不同:,1.ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量(整體水平);ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率（單細(xì)胞水平）；2.ELISPOT比ELISA更敏感。,ELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：自身免疫診斷和預(yù)后分析、器官移植后排斥反應(yīng)的預(yù)測、過敏性疾病脫敏治療的監(jiān)測、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測等。,24,PPT學(xué)習(xí)交流,胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測,LPS活化單核細(xì)胞內(nèi)TNF-的測定R1：淋巴細(xì)胞；R2：單核細(xì)胞,25,PPT學(xué)習(xí)交流,TNF-的誘生和檢測,主要由單核/巨噬細(xì)胞及其他多種細(xì)胞產(chǎn)生，能使殺傷腫瘤細(xì)胞; THP-1(人單核細(xì)胞系)在LPS(脂多糖)刺激下可分泌TNF-; L929(小鼠成纖維細(xì)胞)可被THP-1分泌的TNF-殺傷，且細(xì)胞的死亡率與TNF-活性成正比; 四甲基偶氮唑鹽(MTT)在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶的作用下，被還原呈藍(lán)黑色的MT