1、課題2 月季的花藥培養(yǎng),花藥培養(yǎng) 采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，把發(fā)育到一定階段的花藥，通過無菌操作技術(shù)，接種在人工培養(yǎng)基上，以改變花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育程序，誘導其分化，形成細胞團，進而形成愈傷組織，隨后使愈傷組織分化成完整的植株的技術(shù)。,什么是花藥培養(yǎng)呢？,1964年，印度科學家在培養(yǎng)毛葉曼陀羅的花藥時，首次獲得了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來的單倍體植株。,說明生殖細胞和體細胞一樣，在離體條件下也具有發(fā)育成完整植株的潛能。,自20世紀60年代以來，世界上已有250多種高等植物的花藥培養(yǎng)獲得成功。,我國已經(jīng)培育成功近50種植物的花粉再生植株，如小麥、玉米、大豆、甘蔗、橡膠等。,花藥培養(yǎng)是以獲得單倍體植物為目

2、的而采用的一種方法。 再經(jīng)歷與胚形成的同樣過程，發(fā)育成正常的單倍體植物。 經(jīng)過人工誘導使染色體數(shù)目加倍，重新恢復到正常植株的染色體數(shù)目。 單倍體育種不僅縮短了育種周期，也為新品種的培育開辟了新途徑。,花藥培養(yǎng)在育種工作上的意義,一、 基礎知識,花粉：,花絲,花藥,雄蕊,雄蕊,大多數(shù)被子植物的花藥是由4個花粉囊（少數(shù)植物為2個）組成，分為左、右兩半，中間由藥隔相連。,花粉囊,當花粉囊的壁組織逐步發(fā)育分化時，會形成大量的花粉母細胞（小孢子母細胞）。,花粉是由花粉母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂而形成，因此，花粉是單倍體的生殖細胞。, 花粉,被子植物花粉的發(fā)育要經(jīng)歷： 四分體時期、單核期和雙核期等階段。,精子2個

3、,（一）被子植物的花粉發(fā)育,花粉母細胞,有絲分裂,四分體,減數(shù)分裂,有絲分裂,生殖細胞,精子1個,1個,12個,4個,4個,8個,4個,4個,8個,4個,注意： 二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管細胞核和生殖細胞核。（精子在花粉管中形成） 三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖細胞進行一次有絲分裂，形成兩個精子，這樣的花粉在成熟時，含有一個營養(yǎng)核和兩個精子。 兩個精子和一個營養(yǎng)核的基因型相同。 1個花粉 母細胞,4個小孢子,4個花粉管細胞核,4個生殖細胞核,8個精子,有絲 分裂,A.花粉是花粉母細胞經(jīng)有絲分裂形成的 B.花粉的發(fā)育要經(jīng)歷小孢子四分體時期、單核期和雙核期 C.花粉發(fā)育經(jīng)歷

4、的四分體時期與減數(shù)分裂的四分體時期含義相同 D.花粉母細胞形成花粉粒中精子的過程是一系列減數(shù)分裂的過程,1.下列關(guān)于被子植物花粉的形成，說法正確的是,B,2.下列關(guān)于被子植物花粉發(fā)育的說法，不正確的是,A.被子植物精子的形成是直接減數(shù)分裂的結(jié)果 B.花粉粒是在花藥中的花粉囊中形成的 C.花粉粒在發(fā)育過程中，核先位于細胞中央，在移到細胞的一側(cè) D.被子植物花粉的發(fā)育要經(jīng)歷小孢子四分體時期、單核期和雙核期等階段,A,（二）產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑,移栽,兩種途徑之間無明顯的界限，主要取決于培養(yǎng)基中的激素的種類及其濃度配比。,體細胞胚（胚狀體）： 在組織培養(yǎng)過程中，某些體細胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榕c受精卵發(fā)育

5、成的胚非常相似的結(jié)構(gòu)，發(fā)育過程亦與合子胚類似，被稱為體細胞胚（胚狀體）。,3.下列對產(chǎn)生花粉植株途徑的敘述，不正確的是,A.花粉通過胚狀體階段直接發(fā)育成植株 B.花粉先形成愈傷組織在誘導分化成植株 C.花粉經(jīng)脫分化形成胚狀體，再分化出根，然后誘導生芽 D.兩種途徑并無絕對的界限，主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類和濃度比例,C,先芽后根,1、材料的選擇：不同植物的誘導成功率很不相同。同一植物的不同生理狀況（花期早期初花期） a.花期早期時的花藥比后期的更容易產(chǎn)生花粉植株。一般月季的花藥培養(yǎng)時間選在五月初到五月中旬，即月季的初花期。 b.合適的花粉發(fā)育期（單核居中期與靠邊期之間） 選擇合適的花粉發(fā)育時

6、期也是提高誘導成功率的重要因素。一般來說，在單核期，細胞核由中央移向細胞一側(cè)的時期，花藥培養(yǎng)成功率最高。 為了挑選到單核期的花藥，通常選擇完全未開放的花蕾。,（三）影響花藥培養(yǎng)的因素,盛開的或略微開放的花都不易選做實驗材料！,通常從生長旺盛的植株上取早期現(xiàn)蕾的花藥或花粉進行培養(yǎng)，較易形成花粉植株；取蕾前，供體植株的栽培條件的好壞也影響花粉植株的誘導率。,A .親本植株的生長條件,其他影響因素,B .材料的低溫預處理,有報道稱低溫（如4）預處理一定時間（如48 h）可以明顯促進胚狀體的形成，有的經(jīng)短期高溫（30 40）處理也能夠促進胚狀體的形成，但是不同作物對所需的最適處理溫度和時間要求不同。,

7、C .培養(yǎng)條件,培養(yǎng)溫度通常保持在25左右，光照因作物種類不同而異。在花粉培養(yǎng)的早期，黑暗或弱光條件可能更有利于花粉分裂的啟動。,D. 接種密度,花瓣松動后，微生物就可能侵入到花藥，給材料的消毒帶來困難。,思考,為什么花瓣松動會給材料的消毒帶來困難？P39,二、 實驗操作,（一）材料的選取 （二）材料的消毒 （三）接種和培養(yǎng),（一） 材料的選取,1. 選擇花藥一般通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。,2. 最常用的方法：醋酸洋紅法,某些植物的花粉細胞核不易著色，需采用焙花青鉻礬法，這種方法能將花粉細胞核染成藍黑色。,（二）材料的消毒,花蕾,無菌水清洗,吸干表面水分,0.1的氯化汞溶液

8、 2-4 min,無菌水清洗3-5次,70的酒精浸泡30s,（三）接種和培養(yǎng),滅菌后花蕾，要在無菌條件下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。,在剝離花藥時，要盡量不損傷花藥（否則接種后，容易從受傷部位產(chǎn)生愈傷組織），同時還要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成。,經(jīng)過20-30天培養(yǎng)后，會發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出愈傷組織或釋放出胚狀體。將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進一步分化出再生植株。,每瓶接種花藥7-10個，溫度控制在25左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。,在花藥培養(yǎng)中，特別是通過愈傷組織形成的花粉植株，常常會出現(xiàn)染色體倍性的變化。（主要原因是

9、營養(yǎng)核和生殖核融合造成的。 ）故需對培養(yǎng)出來的植株作進一步的鑒定和篩選。,如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。,三、 結(jié)果分析與評價,1、選材是否恰當,選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。應學會通過顯微鏡觀察處于適宜發(fā)育期的花粉。,2、無菌技術(shù)是否過關(guān),如果出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，說明某些操作步驟，如培養(yǎng)基滅菌、花蕾消毒或接種等有問題。,3、接種是否成功,如果接種的花藥長出愈傷組織或釋放出胚狀體，花藥培養(yǎng)的第一步就成功了。要適時轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，以便愈傷組織或胚狀體進一步分化成再生植株。,植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的比較,基