1、實驗六 細胞骨架的觀察,生命科學學院,細胞生物學實驗,一、實驗目的 掌握細胞骨架的基本制作方法。 了解光學顯微鏡下細胞骨架的基本形態(tài)結構。,二、實驗原理 細 胞 骨 架 ：是 指 細 胞 質 中 縱 橫 交 錯 的 纖 維 網(wǎng) 絡 結 構 ， 由微絲、微管和中間纖維構成。它對細胞形態(tài)的維持、細胞的生長、運動、分裂、分化和物質運輸?shù)绕鹬匾饔谩?用適當濃度的TritonX-100處理細胞，可以去除細胞中的非骨架成分，而將細胞骨架成分完好保存。經(jīng)戊二醛固定、考馬斯亮藍R250染色，光鏡下可以觀察到細胞內(nèi)由微絲組成的微絲束網(wǎng)狀結構，就是細胞骨架。,三、實驗用品： 試劑: M-緩沖液、1Triton

2、X-100、3.0%戊二醛、0.2%考馬斯亮藍R250、蒸餾水 材料: 洋蔥鱗莖 器材：滴管、鑷子、移液槍、小燒杯、載玻片、蓋玻片、濾紙條 設備：顯微鏡、恒溫箱,M緩沖液： 成分：咪唑、EDTA、EGTA、MgCl2等。 咪唑是一種緩沖劑，穩(wěn)定骨架蛋白，維持細胞滲透壓；EDTA和EGTA螯合Ca2+，溶液中提供Mg2+；保持低鈣環(huán)境，使骨架纖維保持在聚合狀態(tài)并且較為舒張。,1% Trion X-100 溶液： Triton X100是一種非離子型去垢劑，可以將細胞質和膜中的游離蛋白和全部脂類溶解抽提，而微絲束不會被Triton 破壞而保留在細胞中。通過Triton的處理，除去部分雜蛋白，使細胞

3、骨架顯現(xiàn)更清晰。 注意：處理時間過長，也會破壞骨架！,0.2% 考馬斯亮藍R250染液： 考馬斯亮藍R250是一種普通的蛋白質染料，可以使細胞內(nèi)各種蛋白質染色。本實驗中，有些骨架纖維(微管，20-25nm)不穩(wěn)定；有些纖維(中間纖維，8-11nm)太細，在光學顯微鏡下無法分辨。 所以，我們觀察到的主要是微絲束，由許多微絲（5-7nm）結合在一起，直徑約在40nm左右，考馬斯亮藍R250染色對微絲束的顯示起了夸大的作用。,3%戊二醛： 戊二醛是一種雙交聯(lián)劑，滲透快、交聯(lián)能力強，對蛋白質的固定效果好，且不破壞細胞骨架的結構。,取材：撕取洋蔥鱗莖近中軸內(nèi)表皮，浸入裝有5ml PBS溶液的小燒杯中 ，

4、使其下沉，處理3次，每次3min。 抽提：吸去 PBS溶液，加 3ml 1 % Triton X-100 入小燒杯，置 37 恒溫箱處理20min。 沖洗：吸去 TritonX-100 ，用 3ml M緩沖液輕輕洗 3 次，每次 3min。 固定：加 5ml 3% 戊二醛固定15min。 沖洗：棄固定液后，用5ml PBS溶液洗3次，每次3min，最后，用濾紙吸去殘留液體。,四、實驗方法與步驟：,染色：吸去 PBS溶液，滴 3ml 0.2% 考馬斯亮藍 R250 染液染色10-15 min。 制片：倒去染液，用蒸餾水清洗 2-3次，將標本平鋪在載玻片上，加蓋玻片。 觀察：光鏡下觀察可見表皮細胞

5、的輪廓，細胞內(nèi)存在著被染成藍色、粗細不等的纖維網(wǎng)絡結構，便是細胞骨架。轉高倍鏡下觀察，轉動微調(diào)可見細胞骨架的立體結構。,五、注意事項： 撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮不可帶莖肉，樣本要展開鋪平。 去垢處理要掌握好時間和溫度。 染色時間需掌握好，必要時可分不同時間進行染色。 觀察時選擇平展、染色適中的部位觀察。,六、作業(yè)及思考：,繪出洋蔥內(nèi)表皮細胞細胞質骨架的分布圖。 1%TritonX-100處理細胞的作用是什么？ M-緩沖液有何作用？,實驗結果：,光鏡的低倍鏡下，可見到規(guī)則排列的長方形洋蔥表皮細胞輪廓，細胞內(nèi)可見到被染成藍色的粗細不等的分枝狀結構，這便是細胞骨架。高倍鏡下繼續(xù)觀察，調(diào)節(jié)細準焦螺旋可以看到細胞骨架的立體結構。,溶液配制： M-緩沖液 咪唑 3.40 g，氯化鉀 3.70g，氯化鎂(MgCl2.6H2O) 101.65 mg，EGTA（乙二醇雙醚四乙酸）330.35mg，EDTA（乙二胺四乙酸）29.22mg，巰基乙醇 0.07ml，甘油 292 ml，蒸留水加至 1000 ml。 1%Triton X-100溶液 Triton X-100 1ml + M-緩沖液 99 ml 。 0.2% 考馬斯亮藍R250染液 考馬斯亮藍R250 0.2 g，甲醇 46.5 ml，冰乙酸 7 ml，蒸餾水 46.5 ml。 3.0%戊二醛 25% 戊