1、微生物基本操作技術，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC姚粟，內容，微生物分類微生物接種和培養(yǎng)微生物的分離微生物的鑒定微生物保藏質量管理微生物，一，微生物分類，一，微生物分類微生物的進化和多樣性，普遍性系統發(fā)育樹，親緣關系，取決于rRNA序列的比較. G. J. Olsen and C. R. Woese、ribosomal RNA : akeytophylogenyinthefasebjournal、73360113-123、1993尺原核生物3360.53mm形狀： -球形棒狀(Escherichia coli) -)螺旋(Rhodospirillum )生長迅速，20min真核生物細胞

2、：線粒體內質網高爾基體液泡，一，微生物分類，http:/micro.magnet.FSU.edu/cells/animals/imals animal cell.jsu http:/www.microscopy.FSU.edu/cells/procaryote s/images/procaryote.jpg，原核生物，一，微生物分類，真核特征形態(tài)特征大姨媽和代謝特征生態(tài)特征遺傳(基因型) 多相分類Polyphasic Texonomy Technology，一、微生物分類微生物的分類等級，“種”是微生物分類中最基本的分類單位。 “種”的定義：一個種(基因型種)是具有相似G C組成，通過DNA雜

3、交試驗判定相似性70%以上的菌株的集合。分類等級界(Domain )門(Phylum )綱(Class )目(Order )科(Family )屬(Genus )種(Species )，雙接種工具微生物接種技術分類斜面接種液體接種穿刺接種平板接種，二、微生物接種和培養(yǎng)，斜面接種左手保持菌種管和斜面管朝上， 用盡量弄平的右手轉動棉塞(硅凝膠塞)，松開后，請握住接種環(huán)，用右手的小拇指、無名指和手掌拔出棉塞，用火焰將管口燒到云同步的接種環(huán)，在燃燒滅菌后插入試管內，選擇蒸發(fā)制冷、細菌，轉移到另一個斜面底部，沿著斜面曲線或二、微生物接種和培養(yǎng)、二、微生物接種和培養(yǎng)、液體接種的操作方法與斜面接種基本一致，

4、只是在把接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時輕輕地摩擦接種環(huán)與管壁接觸的地方，分散菌細胞。 蓋上棉塞，輕輕搖動使之均勻的菌種用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，用移液器或吸管接種。 二、微生物接種和培養(yǎng)，三、微生物接種和培養(yǎng)，用穿刺接種用接種針取出菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內(不扎在底部)，沿原路拔出的方法用于厭氧性細菌接種，檢查細菌的運動能力。 二、微生物接種和培養(yǎng)、二、微生物接種和培養(yǎng)、平板接種平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、菌種的分離純化、活菌的訂正數等平板接觸斜面：平板分散的單菌落斜面接觸平板：點種法、劃線法。 二、微生物接種和培養(yǎng)、三、微生物分離、微生物純培養(yǎng)分離技術、純培養(yǎng)物是指同一細胞球來源的細胞球群。 得到純

5、粹的培養(yǎng)物對微生物學研究很重要。 微生物純培養(yǎng)分離技術，涂布平板法平板劃痕法平板注入法稀釋搖管法，液體培養(yǎng)基分離法單細胞球(孢子)分離法選擇培養(yǎng)基分離法，涂布平板法，1，在平板中央(0.1mL )加入少量樣品2 .在玻璃三角涂棒中浸泡醇3 .帶有醇的涂棒在火焰上烘烤后蒸發(fā)制冷4 .無菌涂棒涂布平板法，樣品適當稀釋30-300CFU/mL，平板劃線法，斜線法曲線法方法眼法放射法四格法，平板劃線法，斜線法：使用接種環(huán)在無菌操作下采集菌混懸劑一環(huán)，首先在平板培養(yǎng)基的一邊進行3-4次平行劃線，曲線法：采集樣品的接種平板劃線法，血瓊脂平板上金黃色葡萄球菌(大金黃色菌落)，平板注漿法，起始樣品連續(xù)稀釋10

6、倍，高稀釋倍數樣品和適當溫度下蒸發(fā)制冷定的瓊脂培養(yǎng)基放入無菌平盤均勻混合，培養(yǎng)得到單菌落。 培養(yǎng)基表面的菌落為圓形，但培養(yǎng)基內部的菌落呈豆狀或透鏡狀。 稀釋搖管法適用于厭氧菌的純培養(yǎng)分離，無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱溶解瓊脂，蒸發(fā)制冷保持50左右，傾斜稀釋的分離對象菌株放入試管中，搖動、冷凝，在瓊脂柱表面注入滅菌流動殘奧片和固體殘奧片的混合物，培養(yǎng)后，菌落在瓊脂柱的中間、液體培養(yǎng)基同樣稀釋度的很多平行試管表明很多數量(一般應該超過95% )沒有增長。 單細胞球(孢子)分離、單細胞球(或單子)分離法通過顯微分離法從混合集團中直接分離出單細胞球或單子個體來培養(yǎng)，得到純粹的培養(yǎng)。 大微生物可以利用毛細管

7、提取各個個體。 個體相對較小的微生物，必須使用顯微鏡操作器，在顯微鏡下用毛細管、顯微鏡針、鉤、環(huán)等選擇各個微生物細胞球和孢子進行單純的培養(yǎng)。 單細胞球分離法對操作技術有較高的要求。選擇培養(yǎng)基分離，選擇培養(yǎng)基特性促生長能力抑制能力指示(鑒別)能力，選擇培養(yǎng)基分離，傳統選擇性培養(yǎng)基血液平板：適合各種細菌生長，一般細菌檢測標本的分離應接種該平板。 營養(yǎng)肉湯：用于標本和各種細菌的增菌朱古力血平板：其中含有v和x因子，適用于接種嗜血桿菌、奈瑟菌等疑似標本。 中國藍平板或伊紅美藍平板：能抑制g細菌，有選擇地促進g菌生長，是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。 麥康凱平板：中強度選擇性，抗菌力強，革蘭氏陰性細菌少，不生長

8、。 SS瓊脂：具有較強的抗菌作用，用于志賀菌和沙門氏菌屬的分離。 鹽化學基瓊脂：用于從糞便中分離霍亂弧菌和其他弧菌。 選擇培養(yǎng)基分離，新的顯色培養(yǎng)基利用微生物自身代謝產生的酶催化劑與相應的顯色基質反應而顯色的原理來檢測微生物的培養(yǎng)基。 基于培養(yǎng)基分離、酶催化劑與基質反應的顯色培養(yǎng)基技術，CHROMagar，Petrifilm 3M，aerobiccountplaterapidcoliformcountplatee.coli/coliformcountplateenterbacteriaceaecountplateyeastandmoldcountplatestaph.aureusexpress

9、countplateenvironmentallisteriaplate酶催化劑和基質微生物鑒定、四、微生物鑒定、多相鑒定(polyphasic taxonomy )是利用從微生物的分子特性到生態(tài)特征的多種不同信息，綜合表型和基因型特征進行微生物分類鑒定的方法。四、微生物鑒定-形態(tài)學觀察、四、微生物鑒定-形態(tài)學觀察、四、微生物鑒定-大姨媽生化、四、微生物鑒定-大姨媽生化、divisionbasedonmembranecomposition 3360 a ) gram-negativehaveouterandinner gram-positivehavenooutermembrane、電池子集(

10、c ) neither gram-nor gram-no http:/www.med.sc.ed BBL Crystal (Becton Dickinson )結合傳統的生化反應、酶催化劑基質顯色反應和熒光增強顯色技術，建立和修訂了鑒定反應的最佳組合。 6種鑒定試驗板可鑒定500種細菌、4種微生物鑒定化學成分分析、4種微生物鑒定基因型分析、G Cmol% 16S rDNA、26srdnad1/d2、5.8srdnaitsregion。 pheS gene、返回gene、rpobgeneandotherhousekeepingenes.dnabarcodingenesequenceanalysi

11、s。 多重序列分析(mlsa ) DNA-dnahybridizationrapd、RFLP、AFLP、SSCP、Eric-PCR、BOX-PCR副溶血弧菌ERICPCR、沙門氏菌屬REP -PCR、四、四作為16srdna序列系統發(fā)育樹、infB基因排列系統發(fā)育樹、2007年Aspergillus brasiliensis sp.nov .的2008年ATCC 16404被認定為Aspergillus brasiliensis sp.nov . 2010年USP更改ATCC 16404的名稱，2010年WDCM更改ATCC 16404的名稱(圖： ATCC 16888和atcc) Sando

12、r Kocsube、Bea ta To th、et al.aspergillusbrasililis abiseriateblackaspergillusspecieswithworld-wide ernationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiologgy 57333 圖： Rep-PCR查詢密碼系統發(fā)育樹(DiversiLab平臺)圖片23360 dendrogramofrep-PCR條形碼(diversilabplatform ) 注意：圖像可從reclassificationofatcc 16404

13、tmandatcc 9642 tmasaspergillusbrasiliensis.pharmaceuticalmicrobiologyforumnewsletter獲取。 Vol. 14 (10): 2-14、表智能運輸系統序列特殊位點鹽化學基差異tabledifferenceofbasepositionitssequence，4、微生物鑒定-鑒定實例2，20000， 2008年ATCC 16404被認定為Aspergillus brasiliensis sp.nov .2010年USP重命名ATCC 16404，2010年WDCM重命名ATCC 16404。 基于圖：曲霉黑色組微管蛋白基

14、因排列的N-J樹figure : neighbourjoiningtreebasedon-tubulinsequencedataofaspergillussectionnigri .注： iliensis sp. abiseriateblackaspergillusspecieswithworld-widedistributioninternational.journalofsystematicandevolutionarymicrobiologgy 57333 基于圖1:智能運輸系統DNA序列的黑曲菌N-J樹figure 1: aneighborjoiningtreeofblackaspergillibasedontheiritsdnasequences c 16404 tmandatcc 9642 tmasasass 在pharmaceuticalmicrobiologyforumnewsletter，2008，vol.14(10 )各種標準中，指定為其他參考菌株的曲霉菌株(CMCC(F) 98003 )需要重新鑒定。 黑曲霉？ 四、微生物鑒定-鑒定例2、 形態(tài)學鑒定CYA培養(yǎng)基25C培養(yǎng)7 d Biolog鑒定生長濁度試驗智能運輸系統rdna區(qū)測序分析智能運輸系統433605-tcctccgcttattgatatgc-3智能運輸系統5