1、氧化應激與消化道功能的關系,主 要 內 容,氧化損傷的機理 氧化應激與消化道損傷 抗氧化劑對氧化損傷的修復作用 展望,氧化 應激,腸炎,腸蠕動紊亂,急性炎癥,心血管疾病,代謝疾病,神經(jīng)紊亂,一、氧化損傷的機理,生物體在代謝過程中，產(chǎn)生許多自由基，這些自由基通常不會導致組織細胞的損傷，機體依靠自身體內的抗氧化防御體系，可以保護機體組織、細胞，防止自由基的損傷。 當生物機體細胞內產(chǎn)生的自由基的水平高于細胞的抗氧化防御能力時，氧化還原狀態(tài)失衡，過量的自由基存在于組織或細胞內，即誘發(fā)氧化應激，并導致氧化損傷。,氧化損傷 DNA氧化損傷 堿基損傷 DNA鏈的斷裂 蛋白質過氧化 受體和酶 細胞膜脂質過氧化

2、 磷脂過氧化,脂質、蛋白質和DNA的氧化會對生物體造成不同程度的危害，從而影響機體的生長、發(fā)育、衰老等過程。急性和慢性的應激都能通過產(chǎn)生自由基誘導胃腸道的氧化應激。 其中對消化道的氧化損傷在動物生產(chǎn)中發(fā)生率最高、隱蔽性強、危害性大。過量的自由基極易誘發(fā)消化道疾病，給畜牧業(yè)的發(fā)展造成巨大損失。,腸道的功能： 消化和吸收營養(yǎng)物質 免疫 內分泌 粘膜屏障 腸道粘膜是機體自身與外環(huán)境接觸的最大界面,具有選擇性滲透吸收營養(yǎng)物質和防御腸道內微生物及致炎因子入侵等屏障功能。,腸粘膜屏障功能 阻止腸腔內有害物質如致病微生物、抗原和促炎因子進入血液循環(huán)的作用，從而維護動物體健康。 當此功能由于各種原因如感染、缺

3、血、燒傷、急性胰腺炎等而損傷時，即可引起腸粘膜通透性增高，進一步引起腸道細菌移位和促炎因子大量釋放，從而加重原發(fā)疾病，甚至誘發(fā)多臟器功能紊亂和衰竭的發(fā)生。,腸粘膜屏障構成 機械屏障 化學屏障 生物屏障 免疫屏障,機械屏障 機械屏障主要由緊密連接的粘膜上皮細胞以及鞘液凝膠層組成。,化學屏障 主要是胃酸、膽汁酸、粘液、溶菌酶、乳鐵蛋白和各種消化酶等對阻止致病因子入侵，維護腸粘膜屏障具有重要作用。,生物屏障 在生理狀態(tài)下機體的腸道存在大量共生細菌，它們通過分泌細菌毒素、產(chǎn)生短鏈脂肪酸、促進腸蠕動、占據(jù)致病菌粘附位點以及爭奪營養(yǎng)素等多個環(huán)節(jié)防止有害細菌的侵入，維護動物體健康。而保持菌群間合適的數(shù)量與比

4、例，對于維護腸粘膜屏障的完整性至關重要。,免疫屏障 腸道相關淋巴組織包括腸集合淋巴小節(jié)，固有膜淋巴細胞和上皮內淋巴細胞，是機體內最大的免疫器官，在腸道執(zhí)行局部免疫功能，并與其它因素協(xié)同作用，維護腸粘膜屏障功能。,二、氧化應激與消化道損傷,氧化應激產(chǎn)生自由基直接作用于細胞發(fā)揮作用。 主要有四種致細胞損傷機制： 1）對脂類和細胞膜的破壞,從而導致細胞死亡。 2）對蛋白質、酶的損傷,從而導致蛋白質變性,功能喪失和酶失活。 3）對核酸和染色體的破壞,從而導致DNA鏈的斷裂,染色體的畸變和斷裂。 4）對細胞外基質的破壞,從而使細胞外基質變得疏松,彈性降低。,對消化道粘膜結構形態(tài)的損傷 腸粘膜中的細胞膜過

5、脂質氧化，損傷腸粘膜組織，腸粘液層變薄、絨毛變短、絨毛表面積減少、隱窩變淺，過氧化物和自由基刺激腸道腺體分泌，引起腸炎的發(fā)生，而腹瀉又加劇了腸道粘膜組織的損傷程度。,氧化應激對消化道功能的影響,對消化道屏障和吸收功能的影響 當腸道內氧自由基增加時，會使腸道中耐受能力較弱的乳酸菌數(shù)量減少，大腸桿菌的數(shù)量上升。 營養(yǎng)素的吸收依賴于腸吸收細胞膜完整性，腸粘膜損傷，致使大量吸收細胞受到破壞，嚴重影響小腸吸收功能。,對腺體的功能影響 氧自由基的提高誘導生長抑素（somatostatin, SS）的分泌，SS具有廣泛的內分泌抑制作用，抑制生長激素、生長調節(jié)素C以及多種胃腸道激素。 仔豬斷奶后，攝入的豆類蛋

6、白種胰蛋白酶抑制因子會引起胰腺炎癥，導致與消化功能紊亂。,正常大鼠腸結構,馬可，2006,靜脈注射LPS后腸道病理變化,對照組 誘導組 修復組 對照組、LPS誘導組和復合抗氧化劑修復組空腸光鏡照片(4),趙珂立，待發(fā)表,胃潰瘍 慢性胃炎 消化性潰瘍 胃癌 結腸疾病,自由基與胃腸道疾病,氧自由基學說認為：幽門螺旋桿菌(Hp)致慢性胃炎的主要因素之一，而其誘發(fā)機制可能同氧自由基有關。,與自由基有關，其中主要與NO及O2-有關，氧自由基能直接作用于細胞的大分子，同時可作為細胞內信息轉導信號引起細胞漿內核轉錄因子(如NF-kB)激活，引起核內有關的基因轉錄增加。是很多急性、慢性炎癥及免疫失調等疾病發(fā)生

7、發(fā)展的分子生物學基礎。,人和動物研究中發(fā)現(xiàn)，病變腸黏膜中ROS產(chǎn)生明顯增多，ROS同疾病活動性相關。,在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)給予自由基清除劑可以預防難治性潰瘍復發(fā)，促進其愈合。,流行病學調查揭示，抗氧化劑如維生素C和維生素E的缺乏與胃癌發(fā)生有關。補充維生素C可減少胃粘膜中的DNA損害。,氧化損傷的檢測方法,直接檢測法 電子自旋共振法 又稱電子自旋共振( electron sp in resonance, ESR) , 是反應活性高、壽命短的自由基最直接最有效的測定方法。 優(yōu)點：靈敏度高,能檢測到絕大多數(shù)的自由基。 缺點：自旋波譜儀價格昂貴,操作復雜, 在普通實驗室中難以推廣。,電子自旋共振波譜儀,化

8、學發(fā)光法 常用魯米諾( luminol, 5-胺基-鄰苯二甲酰環(huán)肼) 、光澤精等作為發(fā)光增效劑。其原理為,魯米諾被ROS自由基氧化成激發(fā)態(tài)的氨基肽鹽離子,當其返回基態(tài)時放出大量光子,從而對化學發(fā)光起放大作用。 操作簡單,價格低廉,目前被廣泛用于ROS的檢測和研究。,間接 測定法 脂質過氧化損傷的測定 測定丙二醛的量常?？煞从硻C體內脂質過氧化的程度,間接反映出細胞損傷的程度。常用硫代巴比妥酸法來測定丙二醛含量,此法是應用最多也是最古老的方法。,DNA氧化損傷的檢測 DNA被氧化時,鳥苷酸的C-8是最易發(fā)生損傷的位點。因而,由此形成的8-羥基脫氧鳥苷是評價DNA氧化損傷最常使用的生物標志物。 8-

9、羥基脫氧鳥苷的特異性單克隆抗體，彗星實驗又稱單細胞凝膠電泳。,蛋白質氧化損傷的檢測 其傳統(tǒng)的檢測技術是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度法或者酶聯(lián)免疫吸附法測定2, 4-二硝基苯肼與蛋白質羰基反應生成的腙,來衡量蛋白質的損傷情況。,抗氧化酶類的檢測 超氧化物歧化酶的檢測SOD SOD能通過歧化作用清除氧自由基，測定SOD的活力可間接反應組織細胞抗氧化損傷、機體清除自由基的能力。直接法和間接法,包括電泳法、免疫法、ESR 法、化學發(fā)光法、脈沖輻解法、紫外分光光度計法等。,谷胱甘肽過氧化物酶的測定 是一種抗氧化酶, 在氧化應激條件下,其在細胞的濃度明顯減少。 可采用紫外分光光度計法、分光光度法或

10、者酶聯(lián)免疫吸附法等進行測定。,過氧化氫酶的測定 過氧化氫酶是一種酶類清除劑，其機制實質上是過氧化氫的歧化,必須有兩個過氫化氫先后與過氧化氫酶相遇且碰撞在活性中心上,才能發(fā)生反應。過氧化氫濃度越高,分解速度越快。一般也采用紫外分光光度法對其進行檢測。,氧化應激導致細胞凋亡的檢測方法 氧化應激導致細胞凋亡的形態(tài)學檢測主要通過光鏡伊紅染色或吉姆薩染色和電鏡對凋亡的細胞進行形態(tài)觀察,可觀察到染色質濃縮,核膜起皺破裂,凋亡小體形成等,以判別細胞凋亡。,磷脂酰絲氨酸外翻分析ROS致細胞凋亡的早期改變之一是細胞膜磷脂酰絲氨酸從細胞膜內轉向細胞膜外。膜粘連蛋白5對轉向到細胞膜外的細胞膜磷脂酰絲氨酸有高度的親和

11、性。用異硫氰酸熒光素標記膜粘連蛋白5,結合使用碘化丙啶對凋亡細胞進行雙染色,即可區(qū)別凋亡細胞與壞死細胞。,DNA片斷化檢測 氧化應激致細胞凋亡時，其染色質發(fā)生濃縮,染色質DNA斷裂,形成50300kb長的DNA大片段,或者180200bp 整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 健康活細胞DNA電泳為一條區(qū)帶,而凋亡細胞DNA 電泳出現(xiàn)特征性的階梯狀條帶。有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種。,陳群，2007,應激24h細胞DNA瓊脂糖電泳圖,氧化損傷致細胞凋亡相關基因的檢測 Bcl-2基因的檢測： Bcl-2的過度表達能阻抑多種凋亡相關基因的表達,如caspase23 的表達。測定方法主要有印跡雜交和實

12、時熒光定量法。 p53基因的檢測；是細胞生長周期中負調節(jié)因子，氧化應激導致細胞DNA損傷的過程必須有p53參與。常采用免疫組織化學、原位雜交等方法來檢測。 核因子kB基因的檢測（NF-kB）：在正常情況下是復合物，氧化應激狀態(tài)下,NF-kB從復合體中解離并向核內移動,與位于核內的基因序列上特異性調控區(qū)結合,從而激活受調控的基因表達。免疫化學染色法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、原位雜交法。,三、抗氧化劑對氧化損傷的修復作用,抗氧化物質主要的作用機制： 通過提供活性基團，作為供氫體與自由基反應，使之形成相應的離子或分子，滅活自由基，終止自由基的鏈式反應； 提高抗氧化酶活性，降低膜的流動性，從而降低自由基反應，達到抑制脂質過氧化作用。,酶類抗氧化劑 超氧化物歧化酶(SOD) 谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px) 過氧化氫酶(CAT) 非酶類抗氧化劑 VE 硒 VC 新型天然抗氧化劑 茶多酚 類黃酮 中草藥 微生物源性抗氧化劑,酶類抗氧化劑對各自由基的作用示意圖,韓雪，2010,不同抗氧化劑對應激小鼠增重的影響,不同抗氧化劑對力竭游泳后小鼠血清中SOD活性的影響,韓雪，2010,不同抗氧化劑對力竭游泳后小鼠血清中MDA含量的影響,韓雪，2010,不同抗氧化劑對力竭游泳后小鼠肝臟中CAT活性的影響,韓雪，2010,復合抗氧化劑對LPS損傷大鼠體重的影響