1、血栓與止血的篩選試驗及其臨床應(yīng)用,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 王鴻利 王學(xué)鋒,1,迄今，檢測血栓與止血的試驗逾百種，大致可分為篩選試驗、確診試驗、排除試驗和基因分析等四大類。本文僅就篩選實驗，如出血時間（BT）、血小板計數(shù)（PLT），活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT），纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDPs）、D-二聚體（D-D），血小板功能分析儀（PFA-100）、血栓彈力圖（TEG）的檢測其臨床應(yīng)用作一簡述。,2,圖1 血管內(nèi)皮細(xì)胞與止血系統(tǒng),3,（一）一期出血缺陷篩檢試驗的應(yīng)用,1.一期止血缺陷 是指血管壁和血小板異常所引起的止血功能缺陷，主要是由于毛細(xì)血管壁通透性、脆

2、性增加或血小板數(shù)量、質(zhì)量異常所致的出血。,4,2.臨床特點 出血以皮膚、黏膜為主，重者可伴有內(nèi)臟出血；但肌肉、關(guān)節(jié)等組織出血罕見。 對壓迫、縫合、外用止血劑或輸注血小板治療有效，但對血漿和血漿凝血因子制品無效。 3.篩選試驗 出血時間（BT） 血小板計數(shù)（PLT）,5,篩選試驗 1.出血時間（BT，模板式刀片法/出血時間測定器法）反映毛細(xì)血管壁與血小板相互作用：毛細(xì)血管的完整性、收縮性以及血小板數(shù)量、功能的實驗。 參考范圍：TBT法：6.92.1 min,6,臨床意義：BT延長（9.0min） （1）PLT與BT呈負(fù)相關(guān)，PLT愈BT愈。 （2）血小板功能異常：血小板無力癥、巨血小板綜合征、灰

3、色血小板綜合征等。 （3）部分凝血因子缺乏：低/無纖維蛋白原血癥、血管性血友?。╲WD）等。 （4）遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥。 （5）藥物：阿司匹林（ASA）、氯吡格雷（玻立維）和阿昔單抗等。,7,方法學(xué)評價 上海瑞金醫(yī)院對126例ITP和20例vWD患者檢測BT結(jié)果列于表1；對BT的三種方法比較見表2。 表1 ITP和vWD應(yīng)用兩種BT法檢測的結(jié)果,* P0.01,8,表2 三種BT檢測方法的比較,9,2.血小板計數(shù)（PLT） 單位容積的循環(huán)血液中所含血小板的數(shù)量 （109/L ）。 方法： （1）直接血小板計數(shù)法（普通顯微鏡法/相差顯微鏡法）； （2）血液分析儀（電阻抗法/光散射法）；

4、（3）流式細(xì)胞儀法。 參考范圍：國內(nèi)：85320 109/L （成人）；通常是100 300 109/L 。,10,臨床意義 （1）血小板減少（100 109/L ）：PLT50 109/L ，出血少見；5030 109/L，外傷性出血；20109/L ，自發(fā)性出血，常需輸注血小板制品。 血小板減少原因：生成減少、破壞增多、消耗過多、分布異常等。 （2）血小板增多（ 400 109/L ）：PLT400 600 109/L，需觀察；PLT 600 109/L，需治療； PLT 600 109/L ，需血小板分離。 血小板增多原因：骨髓增生性疾病、反應(yīng)性血小板增多。,11,方法學(xué)評價 ICSH推

5、薦：一般用血涂片法觀察血小板分布并與計數(shù)核實。 （1）草酸胺稀釋-相差顯微鏡計數(shù)血小板； （2）流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)。 經(jīng)國際11個實驗室用CD41、CD61驗證，該法準(zhǔn)確度、精密度很好，可作為自動血細(xì)胞分析儀的校準(zhǔn)和PLT減少的準(zhǔn)確性的驗證。,12,圖 2 一期止血缺陷的篩選試驗,13,圖3 先天性初期止血異常的實驗室檢查,14,獲得性初期止血異常的實驗室檢查,15,（二）二期止血缺陷篩檢試驗的應(yīng)用,1.二期止血缺陷 是指凝血障礙和抗凝物質(zhì)所引起的止血功能缺陷，主要是由于凝血因子缺乏或體內(nèi)產(chǎn)生病理性抗凝物質(zhì)所致出血。,16,2.臨床特點 出血以肌肉、關(guān)節(jié)為特點、也可有內(nèi)臟、皮膚出血 對血漿、血漿凝

6、血因子制品有效，但對壓迫、外用止血劑和輸血小板療效欠佳。 3.篩選試驗 活化部分凝血活酶時間（APTT） 血漿凝血酶原時間（PT）,17,圖 4 凝血系統(tǒng)及其篩選實驗,18,1.活化的部分凝血活酶時間（APTT） APTT是內(nèi)源凝血途徑的常用和較敏感的篩選試驗。 參考范圍：傳統(tǒng)的是3143s；目前隨著儀器和試劑的開發(fā)，其參考值不一，尚難統(tǒng)一。 正常對照值：傳統(tǒng)的須測對照值，以測定值較對照值延長10s為異常；目前也未統(tǒng)一。 APTTR：患者APTT/正常對照APTT比值，尚未得出參考范圍，尚未推廣應(yīng)用。,19,臨床意義 （1）內(nèi)源性凝血途徑因子缺陷：F（血友病A）、F（血友病B）、F、F、PK和

7、HMWK等遺傳性缺乏癥。 （2）內(nèi)源性凝血途徑因子抑制物存在：常見F、 F抑制物，狼瘡抗凝物（LA），應(yīng)選用鞣花酸為激活劑更敏感。 （3）藥物所致異常：常見肝素（患者APTT/正常人APTT比值為1.52.5為治療范圍）、輸注庫血引起凝血病等。 （4）纖溶活性增強：尤其是多見于繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)（DIC），而原發(fā)性纖溶很少延長。,20,方法學(xué)評價 （1）激活劑：白陶土、硅藻土和鞣花酸的敏感性比較，見表3 表 3 不同激活劑對APTT敏感度比較,21,（2）凝血時間檢測的敏感性比較：瑞金醫(yī)院對血友病患者凝血時間的敏感度作比較,延長率（%）：APTT 95%，硅管法CT100%，ACT100%，而試管

8、法CT為70%，故目前用APTT為篩選實驗簡單、方便、實用。,22,2、血漿凝血酶原時間（PT） PT是外源凝血系統(tǒng)常用和較為敏感的篩選實驗。 參考范圍：傳統(tǒng)法為12 1s（1113s）；目前，隨著儀器和試劑不同，參考范圍也有不同。尚未統(tǒng)一。 正常對照組：傳統(tǒng)法為測定值較正常對照組3s為異常，目前也未統(tǒng)一。 PTR 參考范圍：1.00 0.05，已在應(yīng)用。,23,臨床意義 （1）PT延長：見于遺傳性/獲得性外源凝血系統(tǒng)的凝血因子缺乏；獲得性常見于DIC、依K因子缺乏、口服抗凝劑、肝病；循環(huán)血抗凝物質(zhì)：肝素、FDP、抗因子抗體。 （2）PT-INR 多用于監(jiān)測口服抗凝劑（華法林）。INR1.5提

9、示抗凝劑無效；INR 1.52. 0 用于預(yù)防；INR 2.0 2. 5 常規(guī)抗凝； INR2.5 3.0 重度抗凝；INR 3.0 易致出血。,24,方法學(xué)評價 （1）Hct30%或50%，抗凝劑和血液的比例應(yīng)按下式調(diào)整（表4） 抗凝劑量（mL）=（100-Hct）血液量（ mL） 0.00185 表 4 Hct對PT和APTT測定結(jié)果的影響,25,（2）凝血活酶（組織因子）：兔腦、人腦、重組組織因子（rTF）對PT的結(jié)果，不盡相同。 rTF 人腦兔腦 （3）緩沖劑 其維持血漿pH，防止易變因子失活；如果無緩沖劑，血漿pH增加，PT延長。,26,（三）、篩選試驗的聯(lián)合應(yīng)用,主要是PT、APT

10、T和PLT的聯(lián)合應(yīng)用。,27,1）PT（N）、APTT和PLT（N）,28,2）PT（）、APTT（N）和PLT（N）,29,3）PT（）、APTT（）和PLT（N）,30,4）PT（）、APTT（）和PLT（）,31,5）PT（N）、APTT（N）和PLT（）,32,6）有出血癥狀，但PT（N），APTT（N）和PLT（N）,33,圖 3 先天性凝血異常的實驗室檢查,34,表 獲得性凝血性障礙項目的選擇和應(yīng)用,35,（四）纖溶活性增強篩選試驗的應(yīng)用,1、原發(fā)性纖溶性增強 指組織型纖溶酶原激活物（t-PA）或尿激酶型纖溶酶原活物（u-PA）的活性增強所致纖溶性亢進(jìn) 2、繼發(fā)性纖溶活性增強 幾乎

11、都見于DIC，是指因子a激活激肽釋放酶原（PK）生成激肽釋放酶（KK），KK激活纖溶系統(tǒng)所致纖溶活性增強。,36,3、篩選試驗 纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）測定 D-二聚體測定（D-D）,37,圖5 FDP和D-D的生成,38,1、纖維蛋白原（Fg）和纖維蛋白（Fb）降解產(chǎn)物（FDPs）測定 指纖溶酶同時降解Fg和Fb產(chǎn)生的FDPs。 （1）定性試驗：膠乳凝集法。 陰性：血清FDP含量10g/mL，血漿FDP含量5g/mL，尿液FDP含量2g/mL。 陽性：血清FDP含量10g/mL，血漿FDP含量 5g/mL，尿液FDP含量 2g/mL。,39,（2）定量試驗：ELISA法。包被于固相的

12、FDP抗體與樣本中FDP（抗原）結(jié)合，加入酶標(biāo)抗體后形成夾心復(fù)合物，呈顯色反應(yīng)。 參考值：5 g/mL。,40,2、D-二聚體（D-D）測定 指纖溶酶特異性降解纖維蛋白（Fb）所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。 （1）定性試驗：膠乳凝集試驗。 陰性：無凝集顆粒者，即D-D含量0.5g/mL 陽性：有凝集顆粒者，即D-D含量0.5g/mL 半定量：以0.5g/mL、 0.5g/mL陽性時的最大稀釋倍數(shù)。,41,（2）定量試驗：ELISA法。 參考范圍： 0.5g/mL （3）定量試驗：膠體金法。將血漿加入檢測卡孔內(nèi)，血漿中D-D吸附于包被有D-D單抗膜中，再加入D-D單抗-膠體金耦聯(lián)物溶液，膜中D-D將與金標(biāo)抗

13、體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，用光筆閱讀儀讀數(shù)。 參考范圍： 0.3 mg/L,42,臨床應(yīng)用 （1）纖溶活性增強篩檢試驗的應(yīng)用 FDP正常，D-D正常：多數(shù)為正常人，提示無纖溶過度現(xiàn)象。 FDP陽性，D-D正常：多數(shù)為FDP的假陽性或原發(fā)性纖溶癥。 FDP正常，D-D陽性：多數(shù)為FDP假陰性或繼發(fā)性纖溶癥。 FDP陽性，D-D陽性：多數(shù)為繼發(fā)性纖溶癥，常見于DIC。,43,（2）在診斷DIC中的應(yīng)用 見表 5 表5 FDP和D-D在診斷DIC中的應(yīng)用,44,(3)D-D在排除靜脈血栓（VTE）中的應(yīng)用 D-D測定在排除VTE中有重要價值（表6）。 表 6 D-D測定在排除VTE中的應(yīng)用,45,方法學(xué)評價

14、（1）對VTE的診斷：D-D測定有高度敏感性和陰性預(yù)測值，但特異性較低。因此，D-D測定陰性可排除VTE，陽性不一定是VTE。 （2）D-D測定，WHO規(guī)定用ELISA法，臨界值為500 g/L。因此D-D測定值500 g/L排除VTE，幾乎為100%， 500 g/L診斷VTE的可能性為40%，必須結(jié)合其他影象檢查。,46,（3）D-D測定陰性時，結(jié)合臨床低/中危險度，其排除價值更大；D-D測定陽性時，結(jié)合臨床高危險度和影象檢查診斷價值更大。 （4）FDP和D-D陽性可見于老年人、妊娠、癌腫、DIC、肝病、感染、炎癥、創(chuàng)傷、手術(shù)、溶栓治療、冠心病等。判斷結(jié)果時要充分考慮。,47,（五）DIC

15、篩選試驗的應(yīng)用,診斷DIC必須符合下列4項： （1）引起DIC的基礎(chǔ)疾?。翰∫蛟\斷 （2）有DIC的臨床表現(xiàn)：臨床診斷 （3）DIC的實驗室檢查：實驗診斷 （4）對肝素治療有效：治療診斷,48,臨床應(yīng)用1、國外DIC的記分診斷標(biāo)準(zhǔn)（表9）,49,2、國外DIC的記分診斷標(biāo)準(zhǔn)（表10）,50,3、日本厚生省DIC診斷記分標(biāo)準(zhǔn) 表11,注：計分7分確診DIC，計分6可疑DIC，5則可能性少，可疑時補做：Sfmc、DD、TAT、PAP，動態(tài)plt，抗凝治療有效,51,4、國內(nèi)基層單位DIC診斷標(biāo)準(zhǔn)（1999） 對臨床懷疑，有下列7項中3項即可診斷DIC （1）PLT50109/L或進(jìn)行性 （2）Fg

16、 1.5g/L或4.0g/L，且呈進(jìn)行性變 化 （3）3P試驗（+）或FDP 20mg/L （4）PT縮短/延長3s，或呈動態(tài)變化 （5）外周血涂片破碎紅細(xì)胞10% （6）ESR 15mm/h （7）血凝塊在2h內(nèi)出現(xiàn)溶解現(xiàn)象,52,方法學(xué)評價 1、DIC常用實驗指標(biāo)的評價（表7）,53,2、DIC聯(lián)合實驗指標(biāo)分析（表8）,54,方法學(xué)評價 見表7、表8。 我院對864例DIC患者進(jìn)行統(tǒng)計，它們的敏感性、特異性和診斷準(zhǔn)確率分別為60%、66%和63%；對DIC前期109例患者的敏感性、特異性和診斷準(zhǔn)確率分別為80%、68%和74%。 Wada等（2003）DIC的診斷標(biāo)準(zhǔn)作了前瞻性評價，結(jié)果顯

17、示：敏感性為91%，特異性為97%。 由此可見，所用DIC實驗診斷指標(biāo)，基本上可以滿足臨床需求。,55,（六）自動化儀器在血栓 與止血篩選試驗中的應(yīng)用,1、血栓彈力圖（thrombelastograph，TEG） 承載全血標(biāo)本的測試杯以445左右擺動，當(dāng)杯中凝血啟動，置于杯中的金屬針受到凝血塊生成/溶解的切應(yīng)力作用，隨之一起擺動。金屬針在擺動過程中所產(chǎn)生的電流，經(jīng)電腦軟件處理后，便形成曲線。這種儀器稱血栓彈力儀，所形成的曲線稱血栓彈力圖（TEG）,56,圖6 TEG各參數(shù)的形成,57,表 12 TEG主要參數(shù)及其含量,58,59,臨床應(yīng)用,（1）判斷凝血狀態(tài)：低凝、高凝狀態(tài) 低凝狀態(tài)：R、K值

18、都延長 高凝狀態(tài)：R、K值都縮短 指導(dǎo)血漿制品的選擇 （2）判斷肝素/LMWH療效：有效、過量、抵抗 普通檢測R、K值=肝素R、K值，示無肝素存在 普通檢測R、K值肝素R、K值，示有肝素存在 指導(dǎo)肝素/LMWH使用和魚精蛋白中和,60,（3）判斷抗血小板治療：有效、過量、抵抗 用TEG的血小板定位圖（platelet mapping）。 使用抗血小板藥后血小板抑制率20%為抵抗。 使用抗血小板藥后血小板抑制率50%75%為有效。 （4）評估非心臟手術(shù)后血栓事件的發(fā)生率 應(yīng)該維持MA值67mm將大大降低血栓事件 若MA值 67 72mm，血栓發(fā)生率為16%。 若MA值 72 95mm，血栓發(fā)生率

19、為32%。,61,（5）評估PCI后血栓事件的發(fā)生機率 若PCI后，MA值6568mm，發(fā)生率為10%。 若PCI后，MA值6872mm，發(fā)生率為14%。 若PCI后，MA值72mm，發(fā)生率為60%。 （6）其他應(yīng)用 區(qū)別原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶（DIC） 判斷高凝狀態(tài)原因：凝血亢進(jìn)、血小板活性 鑒別手術(shù)出血：外科出血、內(nèi)科出血,62,2.血小板功能分析儀（platelet function analyzer-100,PFA-100) 體外篩選血小板黏附和聚集的儀器。以標(biāo)有膠原/腺上腺素（CEPI）和膠原/ADP（CADP）兩種纖維膜為誘導(dǎo)劑，以觀察膜孔閉合時間（closure time，CT）為結(jié)果。 參考范圍 CEPI為61203s；CADP：48 187s,63,In Vivo Haemostasis,PFA100.avi,capillary 200m,aperture 150m,epinephri