1、用切目的基因相同的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒,目的基因,1.2基因工程的基本操作程序,專題1 基因工程,目的基因的檢測與鑒定,基因工程的基本操作程序的步驟：,目的基因的獲取,基因表達(dá)載體的構(gòu)建,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,閱讀與思考,1、什么是目的基因？ 2、獲取目的基因的方法有哪些？其操作過程分別是怎樣的？,一、目的基因的獲取,1、目的基因概念： 主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。 (人類所需要的基因，如：抗蟲基因、胰島素基因) 也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。 2、目的基因獲取的方法： 從基因文庫中獲取目的基因 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 化學(xué)方法直接人工合成目的基因,（一）從基因文庫中獲取目的基因,基因文

2、庫 定義（見課本P9）,種類,基因組文庫,部分基因文庫 （如cDNA文庫）,基因組文庫的構(gòu)建過程,基因組文庫,cDNA文庫的構(gòu)建過程,mRNA,單鏈DNA,雙鏈DNA,cDNA文庫,如何從基因文庫中找到所需要的基因？,依據(jù)目的基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù) 基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。,（二）利用PCR技術(shù)擴增目的基因,PCR的全稱： 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR的原理： DNA復(fù)制(體外) PCR技術(shù)擴增目的基因的前提條件： 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。,模板 原料 引物 Taq酶 控制溫度,目的基因DNA,四種脫氧核苷

3、酸,如單鏈DNA分子片段,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,PCR儀自動調(diào)控,PCR的條件：,（高溫變性，低溫復(fù)性，中溫延伸）,PCR的過程：,目的基因DNA受熱變性而解鏈 (90-95),引物與DNA單鏈互補結(jié)合(55-60),DNA聚合酶催化延伸合成新鏈(70-75),（高溫變性，低溫復(fù)性，中溫延伸）,PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的比較,（三）用化學(xué)方法直接人工合成,條件： 儀器：,基因較小，核苷酸序列已知。 DNA合成儀,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,復(fù)制原點+目的基因+標(biāo)記基因+啟動子+終止子,各元件具有怎樣的功能？,1、元件：,啟動子：,終止子：,位于基因尾端，轉(zhuǎn)錄停止的信號,位于基因首端，RNA聚合酶識別

4、和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的：,a.使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。 b.使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,載體與基因表達(dá)載體的區(qū)別：,同：二者均有標(biāo)記基因和復(fù)制原點 異：表達(dá)載體在載體的基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、 終止子三部分結(jié)構(gòu) （其中啟動子、終止子對于目的基因的表達(dá)（轉(zhuǎn)錄步驟）必不可少）,載體的組成： 復(fù)制原點+目的基因插入位點+標(biāo)記基因,基因表達(dá)載體的組成： 復(fù)制原點+目的基因+標(biāo)記基因+啟動子+終止子,三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,1、什么是轉(zhuǎn)化？ 2、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是什么？具體過程是怎樣的？ 3、目的基因?qū)雱?/p>

5、物細(xì)胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？ 4、目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？,轉(zhuǎn)化,目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。,1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,常用的方法: 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉 管通道法,農(nóng)桿菌的特點: a.易感染雙子葉植物和祼子植物。 b.具有趨化性。 c.Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上,1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的導(dǎo)入過程:,構(gòu)建基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入,農(nóng)桿菌,植物細(xì)胞,導(dǎo)入,穩(wěn)定維持和表達(dá),.目的基因?qū)雱游锛?xì)胞,常用的方法: 顯微注射技術(shù) 操作程序：,a.先提純含目的

6、基因的表達(dá)載體 b.從動物體內(nèi)取出卵(受精卵） c.顯微注射儀進(jìn)行顯微注射 d.將含目的基因的受精卵移植到輸卵管或子宮中發(fā)育成新個體,3.目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,原核生物的特點: 繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少。,大腸桿菌的轉(zhuǎn)化過程:,用Ca2+處理細(xì)胞,增加細(xì)胞壁的透性，與細(xì)胞膜無關(guān), 感受態(tài)細(xì)胞,重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,四、目的基因的檢測與鑒定,1、導(dǎo)入目的基因后需要檢測哪些方面？各采取什么方法？ 2、什么是DNA分子探針？檢測時的DNA探針通過什么原理來檢測目的基因和相應(yīng)的mRNA？ 3、利用抗體抗原雜交檢測的原理是什么？,目的基因是否插入

7、受體細(xì)胞染色體的DNA上？,檢測1：,檢測方法:,DNA探針：,用放射性同位素等作標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段。,DNA分子雜交技術(shù),用DNA探針與基因組DNA雜交。,目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA？,檢測2：,檢測方法:,分子雜交技術(shù),用DNA探針與mRNA雜交。,檢測3：,檢測方法:,抗原抗體雜交,目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì),4、個體生物學(xué)水平的鑒定,珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分，當(dāng)它的成分異常時，動物可能患某種疾病，如鐮刀型細(xì)胞貧血癥，假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的珠蛋白，想一想，應(yīng)該如何設(shè)計？,思考與探究,1.從小鼠中克隆出珠蛋白基因的編碼序列（CDNA）。 2.將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。 3.將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含