1、乙肝兩對半測定 酶聯(lián)免疫法,實習生：廖於波 指導老師：李海龍,HBV是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)感染的流行程度差異很大。據(jù)WHO報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌。我國屬高流行地區(qū)一般地區(qū)HBsAg陽性率為7.18%。,乙肝病毒血清標志物,HBsAg 第一個出現(xiàn)，感染后1-2周即可陽性 陽性表示存在HBV感染 HBsAb 出現(xiàn)在HBsAg消失后 保護性抗體 疫苗免疫成功的標志,乙肝病毒血清標志物,HBeAg 病毒復制標志 傳染性強 HBeAb 傳染性降低 長期存在是

2、DNA與肝細胞整合的結(jié)果,乙肝病毒血清標志物,HBcAg HBV復制的標志 血清中難以檢測出來 IgM-HBcAb 急性HBV感染 IgG-HBcAb 急性感染恢復期和慢性持續(xù)感染,檢測HBV病毒血清標志物是臨床最常用的病原學診斷方法。HBV具有三個抗原抗體系統(tǒng)，即乙肝表面抗原（HBSAg）和乙肝表面抗體（HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗體（HBeAb）、核心抗原（HBcAg）核心抗體（HBcAb），由于HBcAg在血液中難于檢出，故臨床免疫學檢測不包括HBcAg，目前常采用酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法檢測。,酶聯(lián)免疫吸附實驗原理,用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原（或抗體）。即用酶標記抗體

3、，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相載體表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果。顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。,乙肝病毒血清標志物檢測原理,標本本要求,采集： 血漿：使用抗凝血漿管（枸櫞酸鹽、EDTA鹽、肝素之一為抗凝劑）采集樣品。樣品離心分離后，提取血漿用于檢測。 血清：采用正確醫(yī)用技術采集標本。離心分離后，提取血清樣品用于檢測。,標本要求,儲存：樣品可存放于28冰箱，24小時內(nèi)測定。若需長時間保存，則應凍存于-20以下，避免反復凍融。上述樣品使用前應恢復到室溫，輕輕搖動混勻。若標本有沉淀物形成，應離心除去，

4、并確定未變質(zhì)方可使用。嚴重融血或脂血標本不可使用。,試劑（安圖生物）,主要組成成分,實驗前準備,1.取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復至室溫（1825）。 2.將恒溫箱或水浴鍋調(diào)至反應溫度。 3.洗液用蒸餾水作20倍稀釋后備用。,檢驗步驟,排板,檢驗步驟,表面抗原（兩步法） 1.留一孔作空白對照，加入樣本稀釋液20ul/孔（含空白孔），其他加入陰性對照三孔和陽性對照二孔100ul/孔及待測標本100ul/孔于相應的反應孔內(nèi)。 2.在微型真當器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。 3.貼上板貼，置37下溫育60分鐘。,檢驗步驟,4.撕下板貼，除空白孔外，各孔加入酶結(jié)合物50

5、ul。 5.在微型振蕩器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。 6.貼上板貼，置37下溫育30分鐘。 7.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。 8.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，37避光溫育30分鐘。,檢驗步驟,9.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)果。 10.使用酶標儀450nm單波長測量各孔的OD值。,檢驗步驟,表面抗體、e抗原、e抗體、核心抗體（一步法） 1.留一孔空白，三孔加入陰性對照、二孔加入陽性對照各50ul/孔，其他各孔分別加入樣本50ul (HBcAb測定時待測血清用生理鹽水1:30稀釋50ul血清+1.5ml生理鹽水) 。 2.除空白孔外，各

6、孔加入酶結(jié)合物50ul。 3.在微型真當器上振蕩30秒使孔內(nèi)液體混合均勻（該步驟非常重要）。 4.貼上板貼，置37下溫育30分鐘。,檢驗步驟,5.撕下板貼，洗板6次，最后在吸水紙上拍干。 6.每孔加入底物液、顯色劑各50ul，37避光反應10分鐘。 7.加終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻后，立即測試結(jié)果。 8.使用酶標儀450nm單波長測量各孔的OD值。,結(jié)果判定,1.肉眼判定,結(jié)果判定,2.酶標儀判定：用酶標儀單波長450nm或雙波長450nm/630nm測定各孔OD值，根據(jù)OD值判定結(jié)果,注意事項,濃縮洗滌液配制前充分搖勻。 加樣本時要加到孔底。 加試劑前應將試劑瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。

7、如果滴加，滴加前應棄去1-2滴。,注意事項,滴加時瓶身應保持垂直，以使滴量準確。勿將試劑滴在孔壁上。 洗滌時各孔須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶殘留。 洗滌時注意孔與孔之間的交叉污染。 脂血，溶血可影響結(jié)果。,注意事項,所有樣本都應按傳染源處理。 樣品顯色深淺與樣品中抗體的含量沒有一定正相關。任何一種測試都不能絕對保證樣品中沒有低濃度的抗體存在。 不同品名、不同批號的試劑不可混用，以免產(chǎn)生錯誤結(jié)果。,影響檢測結(jié)果的因素,1.樣本采集與處理的影響 1.1 標本嚴重溶血。 1.2 標本凝固不全：血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋原。 2、試劑的影響 2.1 不同批號。 2.2 不同廠家。,影響檢測結(jié)果的因素,3.操作技術的影