1、實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解瓊脂糖凝膠電泳的原理 掌握瓊脂糖凝膠的制作及進(jìn)行電泳的方法,實(shí)驗(yàn)原理,凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)。根據(jù)制備凝膠的材料，分為瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺電泳。 瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，它能檢測少量的DNA（如用肉眼觀察，可檢測到10 ng的DNA），且檢測的范圍很廣。,瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45 開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。 DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子

2、的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。,瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。 濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。,DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。 瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測。,溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向正極泳動(dòng)時(shí)，溴化乙錠從正極向負(fù)極移動(dòng)，這樣溴化乙錠分子就會(huì)嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，使DNA在紫外光下發(fā)射

3、很強(qiáng)的熒光。在溴化乙錠足夠的情況下，熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，這樣就可以檢測DNA的濃度。,注意事項(xiàng)：,EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。 實(shí)驗(yàn)過程中操作要保持安靜、鎮(zhèn)定，注意樣品不能污染。,實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑,（一） 儀器 1. 水平式凝膠電泳槽 2. 穩(wěn)壓電泳儀 3. 電爐 4. 紫外檢測儀 5. 臺(tái)式離心機(jī),（二） 材料 實(shí)驗(yàn)一中的PCR產(chǎn)物,（三） 試劑 1.瓊脂糖 2. TAE電泳緩沖液(50) （pH8.0） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙錠溶液 10mg/ml水溶液，室溫，棕色瓶或鋁鉑

4、紙包裝保存。 4. 10DNA樣品上樣緩沖液,溴化乙錠（EB） 是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。 瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般5ng。,核酸染色劑,注意事項(xiàng)： EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。,電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。 作用： 增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。 形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速度和位置。 使樣品呈色，使加樣操作更方便。,上樣緩沖液,實(shí)驗(yàn)步驟：瓊脂糖凝膠

5、制備,1. 洗凈電泳槽、制膠槽、梳子、擋板，晾干。 2. 插好擋板、梳子。 3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需稱取0.4克瓊脂糖，放入制膠 的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml電泳緩沖液（1TAE）。 4. 加熱煮沸，使瓊脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至約60時(shí)，加入溴化乙錠4 L (終濃度為0.5 g/ml)，輕輕搖勻，倒入制膠槽上，檢查有無氣泡。,6. 室溫下約30-45分鐘后，瓊脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和擋板，清除碎膠，將凝膠放入電泳槽中。 7. 加入電泳緩沖液（1TAE）至電泳槽中，使液面高于膠面約1mm。 8.在DNA樣品中加入2 L (1/10體積)的10 DNA上樣緩沖液(load

6、ing buffer)，混勻，稍甩一下，使溶液都處于離心管底。 9.用移液器吸起離心管中溶液，移入凝膠的梳孔中。,10.插上導(dǎo)線，打開電泳儀電源，按照需要調(diào)節(jié)電壓至120V，電泳開始，觀察電流情況或電泳槽中負(fù)極的鉑金絲是否有氣泡出現(xiàn)。 11. 等溴酚藍(lán)泳動(dòng)至凝膠前沿后，將電壓（或電流）回零，關(guān)閉電源，停止電泳。 12. 取出凝膠，在紫外觀測儀上觀察電泳結(jié)果。 13. 根據(jù)需要切下DNA條帶，放入1.5ml Ep管中，放于4保存，以備下實(shí)驗(yàn)用。,PCR產(chǎn)物的 瓊脂糖凝膠電泳,使用3 mg的DNA Marker DL2,000（500 ng/條帶）進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后，各DNA條帶自上至下分

7、別為2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。,關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)技巧和方法幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：,1.）加樣時(shí)槍頭不要碰壞凝膠壁，否則DNA的帶型將不會(huì)整齊，加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液，以趕走樣品空中的氣泡。 2.）每孔最大DNA上樣量決定于DNA樣品片段的大小、數(shù)目及樣品孔形狀與容量。 3.）應(yīng)注意每孔最大上樣容量及樣品孔體積，以免加樣時(shí)樣品流入附近樣品孔造成交叉污染，影響結(jié)果分析。,此外在瓊脂糖凝膠電泳中其它注意事項(xiàng)還有： 1.）凝膠中加入EB進(jìn)行電泳，便于紫外線下觀察電泳狀態(tài)，但EB會(huì)導(dǎo)致線形DNA遷移率下降。 .）電泳過程中，溴化乙錠向負(fù)極移動(dòng)，與DNA泳動(dòng)

8、的方向相反，較長時(shí)間的電泳會(huì)造成靠正極方向的凝膠中溴化乙錠含量低，會(huì)對含量較少的小分子DNA片段檢測困難。處理方法是：將凝膠在0.5ug/ml的EB溶液中染色3045分鐘。 .）判斷正負(fù)極的另一方法是負(fù)極氣泡（H2）比正極氣泡（O2）多一倍。,問答題 1.影響電泳遷移率的因素有哪些？ 2.試述瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理。,復(fù)習(xí)思考題,用多功能DNA純化回收試劑盒（離心柱型）回收DNA,在高濃度鹽離子存在的情況下,DNA片斷選擇性的吸附于離心柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜上,再通過一系列快速的漂洗離心的步驟去蛋白液和漂洗液將引物,核苷酸,蛋白酶等雜質(zhì)去除,最后低鹽,高PH值的洗脫緩沖液將純凈DNA從硅基質(zhì)膜

9、上洗脫。,1在長波紫外燈下,用干凈刀片將所需回收的DNA條帶切下,盡量切除不含DNA的凝膠,得到凝膠體積越小越好。 2將切下含有DNA條帶凝膠放入1.5ml離心管,稱重。 先稱一個(gè)空1.5ml離心管重量,然后放入凝膠塊后再稱一次,兩次重量相減,得到凝膠的重量。 3. 加三倍體積溶膠/結(jié)合液DB。 如果凝膠重為0.1g,其體積可視為100l,則加入300l溶膠液。 456水浴放置5分鐘（或直至膠完全溶解）。每2-3分鐘渦旋震蕩一次幫助加速溶解。,5將上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）, 12,000 rpm離心30-60秒,倒掉收集管中的廢液。 如果總體積超過750l，可分兩次將溶液加入同一個(gè)吸附柱AC中。 6加入700l漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,12,000 rpm 離心1分鐘,棄掉廢液。 7加入500l漂洗液WB 12,000 rpm 離心1分鐘,棄掉廢液。 8將吸附柱AC放回空收集管中,12,000 rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液