1、牛的精液冷凍,主講人： 組 員：,2,實驗?zāi)康?了解牛的精液冷凍保存的基本操作和流程 初步掌握牛的精液冷凍和解凍的基本方法,3,實驗原理,利用-196的液氮、-79的干冰等冷源，將精子經(jīng)過降溫冷凍處理來降低或抑制精子新陳代謝程度從而達(dá)到延長精子在體外生存時間，升溫后又恢復(fù)活性完成受精的目的。,2020/7/24,精子冷凍損傷,物理性損傷 化學(xué)性損傷 氧化性損傷,5,實驗原理,按凍精劑型：主要為顆粒凍精和細(xì)管凍精兩種 細(xì)管型凍精的優(yōu)點是標(biāo)識、分裝、凍結(jié)都可以采用機(jī)械設(shè)備進(jìn)行，且解凍后效果好于其他劑型，運輸使用方便，易識別，不易污染。用細(xì)管凍精對母牛進(jìn)行人工授精時，其受胎率較用顆粒凍精高，效果好。

2、但是顆粒凍精制作成本低，目前國內(nèi)部分地區(qū)仍在使用。,6,實驗材料和儀器,牛的精液樣品 液氮罐、鋁飯盒、燒杯、冰箱、試管、水浴箱、低溫溫度計、顯微鏡、蓋玻片、載玻片,實驗內(nèi)容,1、冷凍稀釋液的配制 12%蔗糖液75mL、卵黃20mL、甘油5mL、 青霉素1000 IU/mL、鏈霉素1000 IU/mL,2020/7/24,蔗糖能溶于水，但不能進(jìn)入精子細(xì)胞，因此在冷凍過程中它能使細(xì)胞外保持在一個高滲透壓水平，引起水分外滲，導(dǎo)致精子皺縮，避免了冰晶的形成，從而有效的保護(hù)了精子細(xì)胞免受冷凍損傷。糖類可減少甘油對精子細(xì)胞的毒害作用，提高精子的活率和頂體完整率。 卵黃能為精子細(xì)胞提供能量，保證了精子正常的

3、生理功能，還具有滲透性緩沖劑的功效，使精子在低滲和高滲狀態(tài)下維持活率，它的使用能起到有效保護(hù)精子冷凍效果的作用。 在稀釋液中添加抗凍物質(zhì)甘油，以增強精子抗凍能力，對防止冰晶的發(fā)生有重要作用。,9,實驗內(nèi)容,2、解凍液的配制 檸檬酸鈉2.9 g、蒸餾水100mL,2020/7/24,正常牛精液呈弱堿性或中性，pH 在 7.07.8 之間，一般來說，精液密度越大 pH值越小，精液密度越小 pH 值越大。檸檬酸鈉等可以起到維持精子生存環(huán)境相對穩(wěn)定，將稀釋液的酸堿度維持在一個相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)，減少因酸堿化而導(dǎo)致精子死亡的作用。,11,實驗內(nèi)容,3、精液的稀釋與平衡 稀釋前先檢查精液的活率，一般不低于0.7，密 度在8億/mL左右，用與精液同溫的稀釋液做2-5倍稀釋。將稀釋后的精液用棉花包裹放入冰箱內(nèi)緩慢降溫到0-5，并保持2-4小時。,12,實驗內(nèi)容,4、滴凍和保存 用吸管吸取平衡后的精液滴于液氮冷卻到-100左右的鋁飯盒的表面（飯盒表面距液氮面2-3cm），制成0.1mL劑量的冷凍顆粒。滴凍要求快速、均勻，滴凍結(jié)束應(yīng)使精液顆粒停留3min，待顆粒由黃變白，即可將飯盒蓋浸入液氮。然后用青霉素瓶或紗布袋收集顆粒，做好標(biāo)記，投入液氮罐中保存。,2020/7/24,實驗內(nèi)容,5、解凍 在1mL容量的試管內(nèi)裝入2.9%的檸檬酸鈉解凍液1mL，放