1、A.草果花部綜合征與開(kāi)花物候花粉在柱頭萌發(fā)的熒光鏡觀察一目的及意義在盛花期，選取開(kāi)花后不同天數(shù)花朵，F(xiàn)AA固定。通過(guò)熒光鏡觀察，初步掌握熒光顯微鏡的使用方法及了解花粉在柱頭上萌發(fā)的狀況。二原理和方法在草果柱頭萌發(fā)的花粉，可用苯胺藍(lán)試劑染色，造成與柱頭或花柱組織染色上的分化而明顯區(qū)別。熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對(duì)襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，可對(duì)草果花粉的熒光現(xiàn)象進(jìn)行觀察和拍照。三材料及藥品材料：盛

2、花期內(nèi)，開(kāi)花不同時(shí)期的花朵藥品：FAA,6mol/L NaOH,蒸餾水，0.05%苯胺藍(lán)（pH9-10磷酸緩沖液）四實(shí)驗(yàn)步棸1. 采集在盛花期，選取開(kāi)花后不同天數(shù)花朵，置于離心管內(nèi)FAA固定，帶回實(shí)驗(yàn)室（FAA的配制：福爾馬林（38甲醛）5ml冰乙酸5ml70酒精90 ml）。2. 用6mol/L NaOH軟化花朵柱頭12h.3. 蒸餾水水洗經(jīng)軟化后的材料。4. 0.05%苯胺藍(lán)浸泡軟化后的材料5-6h（0.05%苯胺藍(lán)染液的配制：苯胺藍(lán)1 g ，溶于 35或95酒精100ml）。5. 熒光鏡下觀察花粉是否萌發(fā)及其在柱頭萌發(fā)的狀況，可觀察到明亮的黃綠色熒光現(xiàn)象，并拍照記錄。五注意事項(xiàng)：1.嚴(yán)格

3、遵從實(shí)驗(yàn)步棸，注意各階段處理時(shí)間。2.制片是注意一定要保持載玻片和蓋玻片的清潔，要維持花粉組織原狀，決不可將組織弄碎。3.片治好后應(yīng)避光保存，而且要盡快觀察，防止熒光的衰減。4. 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。5進(jìn)人暗室后接通高壓穩(wěn)壓器電源，后再開(kāi)啟激發(fā)高壓汞燈，當(dāng)看到高壓汞燈完全亮后，停止激發(fā)，再開(kāi)始觀察標(biāo)本。6.要注意清潔目鏡及物鏡鏡頭，觀察前玻片上不能有水。7. 熒光顯微鏡的激發(fā)裝置及高壓汞燈壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，節(jié)省時(shí)間；汞燈應(yīng)避免多次開(kāi)啟，關(guān)閉高壓汞燈后半小時(shí)內(nèi)絕對(duì)不能重新開(kāi)啟。8.每次使用后要正確關(guān)閉程序及切斷電源，并在記錄本上進(jìn)行登記。實(shí)驗(yàn)材料及

4、場(chǎng)地的選擇：選擇種植5或6年以上，生長(zhǎng)發(fā)育正常的健壯植株，為便于作對(duì)照試驗(yàn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)地考察后靈活選擇溝邊，陰坡，陽(yáng)坡，及不同海拔的場(chǎng)地。OOU,OND兩種草果類型的區(qū)別方法：于早上6:00上山，可看到一種草果開(kāi)始散粉，到8:30左右已基本散盡；而另一種類型早上無(wú)變化，13:00開(kāi)始散粉，16:30左右基本散盡。故，顯而易見(jiàn)，前者為OOU（上午散粉型），后者為OND（下午散粉型）。注：不同天氣對(duì)開(kāi)始散粉時(shí)間和持續(xù)時(shí)間有顯著影響，陰雨天會(huì)有所延遲。開(kāi)花物候和花期方法：標(biāo)記兩種材料各30株，之后可觀察記錄總花期，花序花期，單花花期，并可用相機(jī)拍攝單花開(kāi)花進(jìn)程。在作總花期觀察時(shí)，主要記錄始花

5、期、盛花期和末花期；對(duì)于花序花期觀察，則觀察記錄草果花序開(kāi)花天數(shù)，記錄總天數(shù)（果實(shí)個(gè)數(shù)/總開(kāi)花數(shù)=結(jié)實(shí)率）。每2d對(duì)總花數(shù)、開(kāi)花數(shù)進(jìn)行一次統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算其開(kāi)花百分比（開(kāi)花數(shù)/總花數(shù)=開(kāi)花百分比）；單花花期觀察：?jiǎn)位ㄩ_(kāi)花天數(shù)、最先開(kāi)花和最后開(kāi)花的時(shí)間間隔等進(jìn)行詳細(xì)的記錄?；ǖ男螒B(tài)特征材料：花蕾期標(biāo)記花期相近的健壯植株的花序20個(gè)，花20朵，游標(biāo)卡尺。方法：于花蕾期標(biāo)記花期相近的健壯植株的花序20個(gè)，花20朵，每天觀察一次花蕾，直至花朵開(kāi)放?；ㄩ_(kāi)放當(dāng)天，每隔2 h觀察一次。觀察單花進(jìn)程，測(cè)量柱頭上舉的角度及時(shí)間（此處操作極為困難，可不做）。從早6-7點(diǎn)開(kāi)始，到下午花謝為止。尤其注意早6-7點(diǎn)及下午3

6、-4點(diǎn)區(qū)段，此量區(qū)段應(yīng)連續(xù)觀察。花朵開(kāi)放之后，每天觀察一次，記錄花朵形狀、顏色、柱頭狀態(tài)變化情況等。每個(gè)類型選取10株，每株摘取3朵開(kāi)放的花進(jìn)行觀察、測(cè)量、記錄花瓣和萼片的長(zhǎng)度、顏色、大小，雄蕊和雌蕊各部分長(zhǎng)度、顏色、形狀等。摘取不同時(shí)期的花照相，對(duì)不同時(shí)期的花序進(jìn)行照相.B.草果繁育系統(tǒng)雜交指數(shù)的估算材料：草果植株10株，游標(biāo)卡尺方法：按照Dafni(1992)的標(biāo)準(zhǔn)，在觀測(cè)點(diǎn)選取個(gè)體10株，每株2朵花，進(jìn)行花朵的直徑及開(kāi)花行為的測(cè)量評(píng)判。具體方法是： 花朵直徑6 mm記為3。 花藥開(kāi)裂時(shí)間與柱頭可授粉期之間的時(shí)間間隔同時(shí)或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1。 柱頭與花藥的空間位置同一高度記為0

7、，空間分離記為1。 三者之和為OCI值。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：OCI=0時(shí)，繁育系統(tǒng)為閉花受精型；OCI=1時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性自交型；OCI=2時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交型，有一定一交可能；OCI=3時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性異交型，部分種需要傳粉者；OCI=4時(shí)，繁育系統(tǒng)為異交型，部分自交親和，多數(shù)種需要傳粉者?；ǚ叟咧楸鹊墓浪悴牧霞霸噭翰莨ǘ涿款惛?0朵，F(xiàn)AA固定液（配制方法同上）,離心管，1.0 mol/L HCl，水浴鍋，移液槍，顯微鏡，解剖針。方法：在觀測(cè)地點(diǎn)，隨機(jī)采取花藥尚未開(kāi)裂的花朵，每種類型20朵，用FAA固定液固定（以下內(nèi)容回學(xué)校后實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行）。從固定液中選取大小基本一致、開(kāi)花進(jìn)程相近的花

8、朵10個(gè)，從花中取下花藥，用1.0 mol/L HCl軟化花粉壁。然后細(xì)心的解剖花藥，將花粉全部移人1個(gè)有刻度的離心管，用蒸餾水定容至5 ml。在水浴鍋中于60下水解15 min，震蕩搖勻后用移液槍吸取1 l 的花粉液于載玻片上，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)，每朵花重復(fù)5次。將子房置于載玻片上，將胚珠從胎座中解開(kāi)，觀察并計(jì)數(shù)。每朵花的花粉/胚珠比率用其花藥中的花粉數(shù)除以其子房中的胚珠數(shù)得出。依據(jù)Cruden9的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行授粉方式的判斷。C.草果花粉活力和柱頭可授性花粉活力測(cè)定材料及試劑：每類花序各20個(gè)（在未開(kāi)花時(shí)事先套袋），載玻片，I2KI試液（配方：碘化鉀3g ； 蒸餾水100ml ； 碘1g

9、 先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，待全溶解后再加碘，振蕩溶解后稀釋至100mL，保存在棕色玻璃瓶?jī)?nèi)。）方法：用I2KI染色法測(cè)定花粉活力，標(biāo)記生長(zhǎng)期相近花序每種類型20個(gè)，開(kāi)花前套袋至單花花期結(jié)束。開(kāi)花當(dāng)天每隔2h取樣觀察。每個(gè)花序取3朵花，花粉混勻，取少量的混勻花粉于潔凈的載玻片上，加水一滴，使花粉散開(kāi)，再加一滴I2KI溶液，蓋上蓋玻片，置于室溫下2h 后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察5個(gè)視野，。凡花粉粒被染成藍(lán)色的表示具有生活力，呈黃褐色為缺少生活力的花粉，統(tǒng)計(jì)花粉中紅色花粉數(shù)及藍(lán)色花粉數(shù)，計(jì)算花粉活力=藍(lán)色花粉數(shù)/（藍(lán)色花粉+紅色花粉），即活力花粉占總花粉數(shù)的比例。測(cè)定開(kāi)花前的花粉是否具有活力，開(kāi)花

10、以后每天測(cè)定花粉活力1次，直至花朵凋謝為止。柱頭可授性材料及試劑：每類標(biāo)記20個(gè)花序，聯(lián)苯胺+過(guò)氧化氫反應(yīng)液，凹面載玻片。方法：每種類型標(biāo)記20個(gè)花序，在開(kāi)花前隨機(jī)標(biāo)記當(dāng)天將要開(kāi)放的花，開(kāi)花后每隔2h分別取20朵花的雌蕊，將其浸入含有聯(lián)苯胺+過(guò)氧化氫反應(yīng)液(1%聯(lián)苯胺：3%過(guò)氧化氫：水=4：1l：22(體積比)的凹面載玻片中，若柱頭具可授性，則柱頭周圍呈現(xiàn)藍(lán)色并有大量氣泡出現(xiàn)。以氣泡的多少來(lái)標(biāo)記柱頭可授性的大小。在柱頭上舉時(shí)間段，要增加測(cè)量密度。測(cè)定開(kāi)花前的柱頭是否具有可授性，開(kāi)花以后每天測(cè)定柱頭可授性1次，直至花朵凋謝為止。傳粉（雜交）試驗(yàn)注：套袋要套整個(gè)花序，每個(gè)處理的花序記錄開(kāi)花朵數(shù)以統(tǒng)

11、計(jì)座果率，或每個(gè)處理的花序留下的花朵數(shù)相同。材料及試劑：標(biāo)記每種草果植株各120株，標(biāo)記牌（事先寫好），硫酸紙袋，紗網(wǎng)袋，75%酒精（用于消毒），鑷子，手套。注：本實(shí)驗(yàn)共計(jì)需硫酸紙袋約350個(gè)，紗網(wǎng)袋約40個(gè)。方法及步驟：CK、對(duì)照，不套袋、不去雄、自由傳粉，用于檢測(cè)自然條件下的傳粉情況（每種類型30株）。C1A、自發(fā)的自花傳粉，開(kāi)花前用硫酸紙袋套袋、不去雄，檢測(cè)是否需要傳粉者。（每種類型30株）。已經(jīng)開(kāi)放的花要摘掉（最好選擇還未開(kāi)花的花序直接套袋）C1B、自花傳粉，開(kāi)花前用硫酸紙袋套袋、不去雄，開(kāi)花后收集自花花粉，并在柱頭打開(kāi)后人工授于柱頭上，。（每種類型30株）。已經(jīng)開(kāi)放的花要摘掉（最好選

12、擇還未開(kāi)花的花序直接套袋）C2、同株異花傳粉，開(kāi)花前用硫酸紙袋套袋，避免異株花粉干擾。選擇將要開(kāi)的花朵（用顯微鏡檢測(cè)柱頭上未落有花粉），去雄、用硫酸紙?zhí)状?，同株異花之間人工傳粉，檢測(cè)是否自交親和。（每種類型30株）?；ㄐ蛏衔撮_(kāi)的花芽應(yīng)摘除。C3A、同種類型間人工異株異花傳粉，開(kāi)花前用硫酸紙袋套袋，開(kāi)花當(dāng)天去雄、用同種類型不同植株的花粉進(jìn)行傳粉，用硫酸紙?zhí)状?，檢測(cè)雜交是否親和。即OOU類型花粉授在OOU類型花朵上（30個(gè)花序）OND類型花粉授在OND類型花朵上（30個(gè)花序）C3B、不同類型間人工異株異花傳粉，開(kāi)花前用硫酸紙袋套袋，開(kāi)花當(dāng)天去雄、用不同類型植株的花粉進(jìn)行傳粉，用硫酸紙?zhí)状?，檢測(cè)雜交

13、是否親和。即OOU類型花粉授在OND類型花朵上（30個(gè)花序）， OND類型花粉授在OOU類型花朵上（30個(gè)花序）。C4、檢測(cè)無(wú)融合生殖，去雄、用硫酸紙?zhí)状?、不傳粉，檢測(cè)無(wú)融合生殖情況。（30個(gè)花序）C5、風(fēng)媒的異花傳粉。套紗布(花粉能透過(guò))，隔離昆蟲(chóng)，去雄，檢測(cè)座果狀況是否受采粉者限制（30個(gè)花序）。C6、自然條件下的異花傳粉，不套袋，去雄，自由傳粉，檢測(cè)異花花粉對(duì)其結(jié)實(shí)的貢獻(xiàn)。（30個(gè)花序）試驗(yàn)期間，對(duì)套袋的花朵經(jīng)常進(jìn)行檢查，揭袋換氣、防止花朵霉壞，揭袋時(shí)嚴(yán)格防止昆蟲(chóng)在花間活動(dòng)。果實(shí)成熟時(shí)，分株分朵收集，統(tǒng)計(jì)結(jié)果率。D.草果傳粉系統(tǒng)花粉密度日變化材料：玻片，甘油（若無(wú)可用食用植物油代替），顯

14、微鏡方法：采用玻片捕捉法測(cè)定空氣中花粉密度，以載玻片上每平方厘米捕捉到的花粉數(shù)代表該時(shí)間段內(nèi)空氣中的花粉密度。具體做法是，于盛花期按東南西北4個(gè)方向設(shè)置花粉采集器，即一面均勻涂滿甘油的載玻片，涂面朝上置于離開(kāi)花群體lm處。7：00-18：00每隔1h收片一次，并重新置片。在顯微鏡10倍視野下，每張玻片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)量。訪花昆蟲(chóng)種類和行為的觀察材料：每種材料各隨機(jī)標(biāo)記5株，相機(jī)。方法：每種類型分別隨機(jī)標(biāo)記5株已開(kāi)放的花序連續(xù)觀察5 d，7：00到18：00之間，每小時(shí)統(tǒng)計(jì)30 min內(nèi)在標(biāo)記花序上出現(xiàn)的各種訪花昆蟲(chóng)數(shù)量和種類，對(duì)每種昆蟲(chóng)的訪花行為進(jìn)行攝影、描述，記錄訪花速率、停留時(shí)

15、間。訪花速率、停留時(shí)間是隨機(jī)觀察10只訪花昆蟲(chóng)在lmin內(nèi)訪問(wèn)的花朵數(shù)和在花中滯留時(shí)間的平均值。并收集部分訪花昆蟲(chóng)帶回學(xué)校用于分類鑒定和檢驗(yàn)是否帶有花粉及其附著位置。不同花部處理對(duì)傳粉的影響材料：標(biāo)記牌，鑷子，每種類型植株各10株。方法：A組去除雄蕊B組去除花瓣C組去除雄蕊和花被片D組去除萼片D組對(duì)照組四組處理，對(duì)每一個(gè)個(gè)體均掛牌標(biāo)記，第二天，取下柱頭，放入固定液中固定，鏡檢，統(tǒng)計(jì)柱頭上花粉的數(shù)目。座果率與資源限制型方法：花粉限制：選取60個(gè)花序，標(biāo)記類型，記錄總花數(shù)，進(jìn)行人工輔助授粉。（應(yīng)進(jìn)行多次）疏花：0，10%，20%，50%，80%去葉片：去除葉片1/4，1/2，3/4（因可能對(duì)農(nóng)民收

16、入重大影響，可不做）大小孢子發(fā)育和雌雄配子體發(fā)生的研究方法：在開(kāi)花期，采集草果各種大小的花蕾。用卡諾固定液固定，帶回實(shí)驗(yàn)室。操作方法同花粉在柱頭萌發(fā)的熒光鏡觀察。石蠟切片制作標(biāo)準(zhǔn)操作程序一、 器材和試劑準(zhǔn)備草果柱頭，蘇木精，冰醋酸，甘油，蒸餾水，苯酚（石碳酸），石蠟，酒精，鐵礬（硫酸鐵銨），手術(shù)刀及刀片，手套，大小量筒，酒精燈，大小燒杯，石棉網(wǎng)，搪瓷杯，牛皮紙，染缸，中性樹(shù)膠，玻片，蓋玻片等。（一）載玻片和蓋玻片的清潔1.載玻片和蓋玻片清洗方法(1)鍋內(nèi)倒入適量清洗液（100 mL水+30 m L洗潔精+30 mL 84消毒液）； (2)將玻片逐片放入鍋中, 加熱至沸騰10 min, 停止加熱

17、, 自然冷卻; (3)撈出玻片流水沖洗10min,徹底沖凈泡沫（彈簧夾上后，單片過(guò)水）; (4)將玻片從水中取出, 用蒸餾水沖洗三遍（最好單片過(guò)水）; (5)將玻片放入 95%乙醇（分析純）中浸泡；（6）取出玻片，碼在切片盒，自然干燥（或無(wú)風(fēng)適度高溫干燥）備用；注意：由于蓋玻片很薄，不能同載玻片放在一起處理；蓋玻片從95%乙醇溶液中取出后要放在吸水紙上攤開(kāi)，干燥后，放在小盒子中備用。2.粘片劑（蛋白甘油）的制作及載玻片的預(yù)處理（1）蛋白甘油的制作 取新鮮雞蛋，先將其尖端用眼科剪或撥針挑破一小孔，再將蛋的另一端挑破一小孔并稍加擴(kuò)大，大孔端朝下，使蛋白流入100200毫升的燒杯中（不要蛋黃），以玻

18、棒打拌蛋白完全變?yōu)檠┗钆菽?，然后倒入墊有幾層紗布的漏斗中過(guò)濾而得到透明、清涼的的蛋白液，再加入等量甘油，振搖使之充分混合。一般將其盛入滴瓶或樹(shù)膠瓶中備用，不用時(shí)蓋好防塵。（2）將蛋白甘油倒在小燒杯中，載玻片用彈簧夾夾上后侵入蛋白甘油中，貼壁刮干，放在切片盒內(nèi)晾干備用。二、石蠟組織切片的制作（一）取材注意事項(xiàng)：1.材料質(zhì)量：材料必須新鮮，應(yīng)爭(zhēng)取在死后半小時(shí)內(nèi)處理完畢。2.取材體積：組織塊力求小而?。ê穸炔灰^(guò)5mm，以2mm最佳）3.取材力度：取材器具鋒利。勿使組織塊受擠壓，切割時(shí)不可來(lái)回挫動(dòng)。夾取組織時(shí)，切勿猛壓，以免擠壓損傷組織。取材時(shí)，組織塊可稍大一點(diǎn)，以便在固定后，將組織塊的不平整部

19、分修去。 4.固定形狀：固定盡量保持組織的原有形態(tài) 新鮮組織經(jīng)固定后，或多或少會(huì)產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，有時(shí)甚至完全變形。為此可將組織展平，以盡可能雅持原形。對(duì)神經(jīng)、肌肉、皮膚組織等，則可將其兩端用線扎在木片上或硬紙片上固定。5.切向選擇：選好組織塊的切面應(yīng)熟悉器官組織的結(jié)構(gòu)并據(jù)此決定其切面的走向?？v切或橫切根據(jù)觀察目的而定。 6.材料沖洗：保持材料的清潔組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，先用生理鹽水沖洗，然后再入固定液。7.組織清除：切除(清除)不需要的部分 特別是組織周圍的脂肪等，應(yīng)盡可能清除掉，以免影響以后的程序和觀察。（二）固定1固定液體積為固定組織的20倍為宜，在固定的初期，注意間斷

20、性的輕輕搖動(dòng)。2.固定時(shí)間，至少24h。3.對(duì)肺組織附件：雙固定液即多聚甲醛戊二醛混合固定液:（光鏡和電鏡均可）（I） 0.2M （mol/L）,pH=7.4 PB（磷酸鹽緩沖液）每1升0.2M PB中含NaH2PO42H2O (Mr= 156) 3g Na2HPO412H2O(Mr=358 ) 29g 先加1種鹽溶解后再加入另一種。如果要求較高，可以滅菌。（II）10%多聚甲醛溶液的配制多聚甲醛10 g，加入100mL去離子水中，加1N氫氧化鈉溶液5滴，水浴鍋加熱到70，邊震蕩邊加入1N氫氧化鈉溶液直至溶液澄清（約需5滴），冷卻備用。1N(=1mol/L)氫氧化鈉溶液:4g氫氧化鈉，溶于10

21、0mL去離子水，用硬質(zhì)塑料廣口試劑瓶裝。（III）2.5%戊二醛+2%多聚甲醛混合固定液 1L10%多聚甲醛 200mL 25%戊二醛 100mL (如果為50%戊二醛時(shí)，用50mL)0.2M PB 500mL 去離子水 補(bǔ)致 1000mL（三）修快和洗滌1.修塊之前（或之后），需要用自來(lái)水對(duì)組織塊進(jìn)行洗滌。最好將塊修好后，標(biāo)記好，放在密閉的鏤空鐵盒中微流水沖洗。一般新固定的組織沖洗6-8h，長(zhǎng)期固定的組織24-48h。2.修快厚度2-3mmX15mmX15mm。修塊的目的是為了，后面的包埋，特別要注意切向和切面問(wèn)題，切面要平整，以方便在包埋時(shí)能立在紙盒中。一定要至少保留將來(lái)的切片中至少能見(jiàn)到

22、有一面為組織器官的被摸面，其他面如需要修整，最好取直角，方便展片。（四）脫水程序：50%酒精（30min）70%酒精（30min）80%酒精（30min）95%酒精I(xiàn)（30min）95%酒精I(xiàn)I（30min）純酒精I(xiàn)(30min) 純酒精I(xiàn)(30min) 注意：（1）高于80%的酒精不能時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則組織易脆。（五）透明程序：酒精-二甲苯（2:1）（6h），純酒精-二甲苯（1：1）（6h）二甲苯I(過(guò)夜，不超過(guò)10h) 二甲苯II(過(guò)夜，不超過(guò)10h) 二甲苯II(過(guò)夜，不超過(guò)10h)注意：透明時(shí)間一般取短（10min），以組織塊剛透明為宜。（六）浸蠟常溫放置小蠟塊于瓶中2-3天放置烘箱40度

23、1天調(diào)溫至60，2/3剩余液1/3蠟（10h）1/3剩余液2/3蠟10h全蠟三次10h/次(過(guò)夜)程序：石蠟(52-58)I(30min)石蠟(52-58)II(30min)石蠟(52-58)III(30min)注意：（1）溫箱溫度一般高于蠟的熔點(diǎn)5，設(shè)定在65-70。（2）蠟必須提前加熱融化后，放入溫箱內(nèi)保溫平衡2-4h。（3）盡量將透明的二甲苯控凈。（七）包埋1.切面向下，每個(gè)蠟塊可以包2-4個(gè)組織，每個(gè)紙盒可以包多個(gè)蠟塊。2.先將熱包埋蠟（可以加適當(dāng)比例蜂蠟）倒入紙盒內(nèi)，用小鑷子擺好組織塊，全過(guò)程有電熱吹風(fēng)機(jī)吹熱分，以保證蠟處于融化態(tài)。3.迅速冷卻，等表面凝固后輕輕將蠟盒轉(zhuǎn)移到冷水，加速

24、凝固。（八）切片、展片和烤片1.修塊：修成正方形、長(zhǎng)方形或梯形，受刀面一定要平行，組織周圍留約2 mm的石蠟邊。2.粘塊：有時(shí)要將蠟塊牢固地粘到小木塊上，注意切面和受刀面平直。如果氣溫高粘好塊后，可以放在4冰箱里，先預(yù)冷。3.刀要鋒利，刀口要與切面（約25度角）和受刀面平行。先20-50微米的粗切修面，然后調(diào)到5微米。為連成帶狀，需要哈氣，增加水汽表面張力，使切片展開(kāi)。毛筆轉(zhuǎn)入干凈硬紙上。4.水浴40左右。先用撥針將蠟片分開(kāi)，光面貼水，在水浴中展開(kāi)后撥去多余的蠟。5.用載玻片（注意標(biāo)記和記錄）撈取組織，并調(diào)節(jié)到最佳位置。一張載波片上可以放1-3塊蠟片。將玻片水平放在玻片板上，放在空氣中或37烘箱內(nèi)晾干。（九）染色將烤好的切片，用彈簧夾夾好，（注意有組織面方向要朝向一面，邊上的一塊保證組織面向里。常規(guī)石蠟切片HE染色程序簡(jiǎn)介步驟試劑時(shí)間1二甲苯I10min2二甲苯II10min（脫蠟必須完全）31/2 二甲苯10min4無(wú)水乙醇I5min 5無(wú)水乙醇II5min695%乙醇I5min795%乙醇II5min880%乙醇5min950%乙醇5min1030%乙醇5min11蒸餾水3 min12蘇木素液5min(可以適當(dāng)延長(zhǎng))出時(shí)瀝凈 過(guò)夜超過(guò)12h13流動(dòng)自來(lái)水洗5 min14分色液：鐵礬數(shù)秒（3-5Sec）15流動(dòng)自來(lái)水洗30 min1680%乙醇1-