1、動(dòng)物肝臟DNA的制備和鑒定,甘肅中醫(yī)藥大學(xué),1,核酸的分類,DNA (脫氧核糖核酸) 主要存在于細(xì)胞核的染色體中。 核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。 RNA（核糖核酸） 存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。,2,核酸的理化性質(zhì),在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在,微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑,在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。,DNA溶液粘度很大，RNA的粘度較小,在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液

2、中沉降下來(lái),3,濃鹽法：利用RNA和DNA在不同鹽濃度溶液中的溶解度不同將二者分離。 離子去污劑法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，直接從生物材料中提取DNA。 苯酚抽提法：苯酚既是蛋白變性劑，又能抑制DNase的降解。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA連接鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。,基因組DNA的提取方法,4,核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。 去垢劑的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)

3、，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)； 3對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。,如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉,5,作用： 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。 2.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制 RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。,如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC,核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑,6,核酸制備中常用的酶 DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白質(zhì) 溶菌酶：破碎細(xì)胞,7,核酸提取的主要步驟,沉淀核酸，去除鹽類，有機(jī)溶劑等雜質(zhì),除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子：酚/氯仿抽提

4、、蛋白變性劑（SDS、異硫氰酸胍等）、蛋白酶處理、高鹽洗滌,除去其它不需要的核酸分子,破碎細(xì)胞：研磨、組織勻漿、超聲、凍融；異硫氰酸胍、堿裂解；酶解（溶菌酶）,8,注意事項(xiàng),加入RNA降解酶除RNA,加入DNA酶抑制劑：檸檬酸、氰化物、砷酸鹽、EDTA、SDS、苯酚等,蛋白變性劑反應(yīng)不宜過(guò)于劇烈,避免過(guò)酸、過(guò)堿及高溫,9,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、學(xué)習(xí)并掌握用濃鹽法從動(dòng)物組織中的提取DNA方法及其原理。 2、學(xué)習(xí)和掌握二苯胺法測(cè)定DNA的原理和方法。,10,二、實(shí)驗(yàn)原理,核酸在真核細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，用DNP和RNP表示。 DNA-Pro（DNP） 細(xì)胞核 RNA-Pro(RNP)

5、核仁及細(xì)胞質(zhì),溶于高鹽溶液（1mol/L）, 微溶于低鹽溶液（0.14mol/L） 溶于低鹽溶液（0.14mol/L） 微溶于高鹽溶液（1mol/L）,11,核酸含量的測(cè)定方法：紫外吸收法、定磷法和分別針對(duì)DNA和RNA的顏色反應(yīng)方法。 脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成-羥基-酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在595nm處有最大的吸收 。 DNA20400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。,12,三、實(shí)驗(yàn)試劑,95%冷乙醇、NaCl固體,二苯胺：稱取純二苯胺1g溶于100ml冰醋酸中，加入10ml過(guò)氯酸，混勻。臨用時(shí)加1m

6、l1.6%乙醛溶液，所配置試劑應(yīng)為無(wú)色。,0.14molL NaCl0.05molL 檸檬酸鈉緩沖液(PH=6.8),DNA標(biāo)準(zhǔn)液200ug/ml:DNA鈉鹽用5mmol/L的NaOH配制。,氯仿/異戊醇=20：1（V/V）,5% SDS,13,組織搗碎勻漿機(jī),14,15,16,除去蛋白質(zhì)的方法,SDS（十二烷基硫酸鈉）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA,防止DNA酶的降解，提取時(shí)可加入適量EDTA（乙二胺四乙酸）、檸檬酸，以降低DNA酶的活性,氯仿一異成醇使蛋白質(zhì)變性，離心除去變性蛋白質(zhì),17,DNA的定量測(cè)定,18,DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml，作為待測(cè)品。,混勻，60水浴保溫45min，冷卻后，595nm處，比色。,19,以吸光度A595nm對(duì)DNA含量（ug）作圖， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的DNA含量。 計(jì)算100g豬肝中DNA的含量： 待測(cè)樣品中DNA的質(zhì)量25(稀釋倍數(shù)) 稱取豬肝的質(zhì)量,=,20,勻漿（破碎細(xì)胞）要充分，需剪成小塊。 固體NaCl應(yīng)磨碎，加入應(yīng)分批緩慢加入，邊加邊搖，避免局部濃度過(guò)大或者未及溶