1、農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)研究進展摘要： 近幾年，隨著生活水平的提高，人們對農(nóng)產(chǎn)品尤其是水果、蔬菜的食用安全越來越重視，相繼開展了無公害、綠色農(nóng)產(chǎn)品計劃，其主要工作內(nèi)容之一就是監(jiān)測、治理農(nóng)藥殘留超標問題。目前用于農(nóng)藥殘留快速檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）和酶抑制法（EM）。酶聯(lián)免疫法（ELISA）對設(shè)備要求不高，操作便捷，適用于大容量樣本分析，但其特異性強，一種試劑盒只能檢測一種殘留物，不能檢測殘留總量，不便于在基層使用推廣。而酶抑制法（EM）因其檢測儀器造價不高，試劑生產(chǎn)已成規(guī)模，穩(wěn)定性好，操作簡便、速度快，特別適宜現(xiàn)場檢測和對大批量樣品的篩查，已是目前普遍使用的快速檢測方法。雖然酶抑制

2、法（EM）已在各地各級機構(gòu)普遍使用，但由于采用不同的儀器、不同廠家生產(chǎn)的試劑，以及操作不規(guī)范等原因，在檢測過程中會出現(xiàn)各種問題，影響到結(jié)果的判定和一定區(qū)域內(nèi)檢測結(jié)果的統(tǒng)一。下面就目前市場上常用酶抑制法（EM）快速檢測農(nóng)藥殘留的方法和在檢測過程的注意事項作進一步分析與闡述（1 李艷霞, 張保東. 農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究J. 周口師范學院學報,2005, 22(5): 79-82.）關(guān)鍵詞 農(nóng)藥 酶抑制 發(fā)光細菌 電子生物 化學速測隨著環(huán)保意識和健康意識的加強! 農(nóng)藥殘留危害性越來越受到重視 許多國家制訂了食品中農(nóng)藥殘留限量! 加強了關(guān)鍵檢測技術(shù)的研究和應(yīng)用 傳統(tǒng)的檢測技術(shù)如氣相色譜技術(shù)由于檢測成

3、本高# 檢測時間長! 不能對蔬菜進行有效的產(chǎn)前# 產(chǎn)中# 產(chǎn)后監(jiān)督管理 為了有效地快速監(jiān)督管理農(nóng)藥殘留的直接危害! 農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)非常重要 近幾年! 在各個領(lǐng)域展開了農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)研究! 快速檢測技術(shù)突飛猛進 目前研究和應(yīng)用較多的快速檢測技術(shù)主要有活體檢測法# 化學檢測法# 酶抑制法# 免疫分析法# 儀器分析法等（梁祈，魏雪芳.中藥材黃芪中有機氮農(nóng)藥殘留量的液相色譜檢測方法J.分析測試學報，2000，（3）1 酶抑制檢測法酶抑制檢測法用于檢測蔬菜和水果中的有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。其原理是將乙酰膽堿酯酶與蔬菜或水果提取液混合，以碘化乙酰硫代膽堿為底物，二硫雙硝基苯甲酸為顯色劑

4、，經(jīng)過一定時間后比色，根據(jù)吸光值計算乙酰膽堿受抑制的程度。如果提取液中不含農(nóng)藥或殘留量很低，酶的活性就不被抑制，試驗中加入的基質(zhì)會被水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑產(chǎn)生顏色反應(yīng)。如果提取液中含有農(nóng)藥且殘留量較高，酶的活性被抑制，基質(zhì)就不會被水解，加入的顯色劑就不顯顏色或顏色變化很?。?2 沈強1 農(nóng)藥殘留分析研究, 農(nóng)業(yè)科技與信息, 2007( 6) : 63) 651）。由于水果、蔬菜類產(chǎn)品具有保存時間短的特點，因此要求快速檢測的時間要短，能在較短的時間內(nèi)檢測出有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥在果蔬中的殘留量，將殘留超標的產(chǎn)品控制在市場之外，防止食用引起急性中毒。酶抑制檢測法能在短時間內(nèi)檢測大量樣本，

5、成本低，技術(shù)要求不高，易于在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地和批發(fā)市場推廣，是目前我國控制農(nóng)藥殘留的一種有效方法（卜偉, 陳軍1 農(nóng)藥殘留分析樣品前處理新方法, 環(huán)境科學與管理, 2007, 30 ( 4) 1）。我國已制定了甲胺磷、氧化樂果等8 種有機磷農(nóng)藥和可百威、地滅威等10 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準。上海、廣州、南京、北京等地的果菜批發(fā)市場已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用這種檢測方法。酶抑制檢測法應(yīng)用的農(nóng)藥殘留速測儀由上海光學技術(shù)研究所、北京普析通用儀器有限公司等單位生產(chǎn)。檢測5-6 個樣品的全過程需要35 分鐘，每個樣品的檢測時間在7 分鐘以內(nèi)。按3 次重復計算，每個樣品檢測成本在6-7 元，是成本

6、最低的檢測方法。采用此種方法籌建檢測實驗室，儀器購置費用為3 萬元左右。但酶抑制檢測法也有很大的局限性。只能用于檢測有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，而且不能給出定性、定量結(jié)果，檢測的精度也不高，不能作為法律仲裁的依據(jù)。1 李艷霞, 張保東. 農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究J. 周口師范學院學報,2005, 22(5): 79-82.）2酶聯(lián)免疫檢測法酶聯(lián)免疫檢測法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)研制而成的一種農(nóng)藥殘留快速檢測方法，主要是采用試劑盒進行檢測。目前我國市場上酶聯(lián)免疫法成品試劑盒還不能實現(xiàn)國產(chǎn)化，全部依賴國外進口。能夠進行檢測的農(nóng)藥種類比較少，只能檢測殺蟲劑15 種、殺菌劑4 種和除

7、草劑16 種。酶聯(lián)免疫檢測法具有專一性強、靈敏度高、速度較快、操作簡單等優(yōu)點。但由于實際使用的農(nóng)藥種類多，制備抗體的難度大，在不能肯定樣本中存在農(nóng)藥殘留種（農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)及其應(yīng)用王守國（黑龍江農(nóng)牧水產(chǎn)職業(yè)學院 黑龍江 北安 164094）3 活體生物測定3.1 利用發(fā)光細菌檢測農(nóng)藥殘留發(fā)光細菌體內(nèi)的熒光素在有氧時經(jīng)熒光酶的作用會產(chǎn)生熒光，但當受到某些有毒化合物的作用時發(fā)光會減弱，其減弱的程度與有毒物的質(zhì)量濃度呈一定的線性關(guān)系，利用這一特性對農(nóng)藥殘留試樣進行測定。 該方法的特點是快速、簡便、靈敏、價廉，是檢測蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留的一種快速、有效的方法，經(jīng)稍加改進還可應(yīng)用于蔬菜以外的農(nóng)產(chǎn)品如

8、水果、稻米中的毒物檢測。袁東星等 1 8 探討了采用發(fā)光細菌對甲胺磷、水胺硫磷、氧樂果、敵敵畏、辛硫磷、甲基異硫磷等6 種常用有機磷農(nóng)藥的檢測狀況。 分析表明，隨著試樣中有機磷農(nóng)藥質(zhì)量濃度的增加，發(fā)光細菌的發(fā)光強度降低，發(fā)強度與農(nóng)藥質(zhì)量濃度呈負相關(guān)。 發(fā)光細菌檢測法的最小農(nóng)藥檢出質(zhì)量濃度為3 mg/L，足以滿足現(xiàn)場快速檢測中的半定量要求。梁祈，魏雪芳.中藥材黃芪中有機氮農(nóng)藥殘留量的液相色譜檢測方法J.分析測試學報，2000， 3.2 利用大型水蚤檢測農(nóng)藥殘留該方法的原理是將蔬菜汁按ISO標準稀釋，每個劑量10個水蚤，測定24、48、96 h的實驗結(jié)果，以實驗水蚤的心臟停止跳動作為最終死亡指標，

9、測定半數(shù)致死濃度。袁振華等19 對該類測定方法作了探索性的研究，結(jié)果表明大型水蚤測試技術(shù)完全適用于蔬菜中的農(nóng)藥殘留測定，并認為該方法具有快速、靈敏、簡便、經(jīng)濟等特點。1 李艷霞, 張保東. 農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究J. 周口師范學院學報,2005, 22(5): 79-82.）3.3 利用家蠅檢測農(nóng)藥殘留將高敏感性的家蠅置于菜汁中，45 h后家蠅死亡率10%以下即定為合格農(nóng)產(chǎn)品。 該方法的優(yōu)點是對產(chǎn)品中各種有毒物質(zhì)均可進行測定，無需儀器，無需前處理，靈敏度比較高。 中國農(nóng)科院植保研究所的王政國進行了大量研究工作，并選育出了一種敏感性高的家蠅品系20 。4 生物傳感器法生物傳感器通常是對特定種類化

10、學物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可反應(yīng)的分析裝置。 傳感器的生物敏感層與復雜樣品中特定的目標分析物(如酶與底物、抗體與抗原、外源凝集素與糖、核酸與互補片段) 之間的識別反應(yīng)會產(chǎn)生一些物理化學信號( 如光熱、聲音、顏色、電化學)的變化，這些變化通過不同原理的轉(zhuǎn)換器(如光敏管壓電裝置、光極光敏電阻、離子選擇性電極等) 轉(zhuǎn)換成第二信號(通常為電信號)，經(jīng)放大后顯示或記錄。 此研究在測定方法多樣化、提高測量靈敏度、縮短反應(yīng)時間、提高儀農(nóng)藥殘留分析樣品預處理研究進展農(nóng)藥殘留分析樣品的預處理包括提取與凈化, 根據(jù)農(nóng)藥的性質(zhì)、樣品種類、試驗條件, 可選用的常規(guī)提取方法有浸漬一震蕩法、索氏提取法和超聲波提取法

11、。由于被測目標物質(zhì)的濃度越來越低, 穩(wěn)定性隨時空變化, 給分析檢測帶來了一定困難。因此急需發(fā)展簡單、快速、有效的樣品前處理方法。近年來發(fā)展較快的方法, 主要有固相萃取(Solid PhaseExtraction, SPE) 、固相微萃取( Solid PhaseMicro 一extraction, SPME) 、超聲波(Ultrasonic Extraction,USE) 、超臨界流體萃取(Supercritical Fluid Extraction, SFE) 、微波輔助萃取(Microwave Aided Extraction, MAE) 等方法。111 固相萃取方法及其在農(nóng)殘分析中的應(yīng)用

12、固相萃取( Solid Phase Extraction, SPE) 是一種應(yīng)用較多的樣品前處理技術(shù), 由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)結(jié)合發(fā)展而來的。具有回收率高, 分離效果好, 操作簡單, 省時、省力等優(yōu)點。適用于分離保留性質(zhì)差別很大的化合物。李艷霞, 張保東. 農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究J. 周口師范學院學報,2005, 22(5): 79-82.）112 固相微萃取方法及其在農(nóng)殘分析中的應(yīng)用固相微萃取( So1id Phase Micro 一Extraction, SPME) 原理是利用待測物在基體和萃取相間的非均相平衡, 使待測組分擴散吸附到石英纖維表面的固定相涂層, 待吸附平衡后, 再與氣相

13、色譜(GC) 或高效液相色譜(HPLC) 聯(lián)用以分離和測定待測組分。SPME 與GC 聯(lián)用適于分析揮發(fā)性有機物, 通過熱使待測組分與纖維分離。而對于難揮發(fā)的有機物可利用SPME 與HPLC 的聯(lián)用技術(shù), 通過溶劑解吸的作用達到分離的效果。在SPME 方法中, 被測物質(zhì)的萃取量取決于樣品基質(zhì)和固定涂層中的分配平衡。分配系數(shù)越大,萃取率越高, 檢出的濃度也就越佳。11 3 超聲波方法及其在農(nóng)殘分析中的應(yīng)用超聲化學利用超聲波來加速物質(zhì)的化學反應(yīng)或啟動新的反應(yīng)途徑或改善其溶解、結(jié)晶分配等物理化學性能, 以提高化學反應(yīng)產(chǎn)率或獲得新的化學反應(yīng)物質(zhì)或提高物質(zhì)的分離提取效率。在食品分析方面, 超聲波主要用于提

14、取過程。超聲波空化可以產(chǎn)生微沖流, 能有效打破邊界層, 使擴散速度增加, 從而使萃取或浸出速度提高2 一10 倍。11 4 超臨界流體方法及其在食品農(nóng)殘分析中的應(yīng)用所謂超臨界流體是指處于臨界溫度和臨界壓力的非凝縮性的高密度流體。這種流體介于氣體和液體之間, 兼具二者的優(yōu)點。超臨界流體萃取是指利用處于超臨界狀態(tài)的流體為溶劑對樣品中待測組分萃取的方法。影響SFE 效率的因素主要是萃取劑的選擇。其次還受萃取條件( 包括壓力、溫度、萃取劑流量及萃取時間等) 、物料性質(zhì)( 包括物料的粒度、樣品中水分及萃取劑的極性等) 、分離條件( 包括分離時的壓力與溫度等) 的影響。11 5 微波輔助萃取方法及其在農(nóng)殘

15、分析中的應(yīng)用微波輔助萃取( Microwave Assisted Extraction, MAE) 是利用微波能強化溶劑萃取效率, 使固體或半固體試樣中的待測組分與基體有效分離, 并能保持待測組分的原本化合物狀態(tài)的一種新的少溶劑樣品前處理方法。MAE 中溶劑的器自動化程度和適應(yīng)現(xiàn)場檢測等方面已取得了很大進展。根據(jù)生物傳感器的信號轉(zhuǎn)換器不同，又可分為電化學傳感器、光學傳感器、測熱型傳感器、半導體傳感器等 2 1 。4.1 電化學生物傳感器電化學生物傳感器以電化學電極為信號轉(zhuǎn)換器，和酶、微生物、動植物組織等其他生物識別元件結(jié)合組成。 酶電極把固定化酶和電極結(jié)合在一起，當酶電極浸入被測溶液時，待測底

16、物進入酶層發(fā)生酶促反應(yīng)，產(chǎn)生或消耗一種可被測定的電活性物質(zhì)( 可氧化或還原的物質(zhì)) ，由電極對其響應(yīng)，將化學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，從而加以檢測。王翔22利用乙酰膽堿酯酶與有機磷農(nóng)藥之間的特殊的親和力，優(yōu)化以乙酰膽堿酯酶為固定相的生物傳感器的實驗條件，采用石英晶體作惰性載體的材料，建立相應(yīng)的理論模型，通過實驗得到酶固定的最佳pH值及酶濃度環(huán)境，并對敵百蟲溶液進行測定，證明了p H 值和濃度條件的合理性。 制備出的有機磷生物傳感器，可實現(xiàn)檢測過程中的自動化和連續(xù)性，滿足現(xiàn)場環(huán)境監(jiān)測的要求，并可向市場化發(fā)展。 電化學分析方法具有適用范圍廣、快速、靈敏、性能穩(wěn)定等特點，其技術(shù)也日益發(fā)展完善。 2 高蕓,

17、朱曉蘭, 林輝, 等1加速溶劑萃取2氣相色譜法測定土壤中有機氯農(nóng)藥殘留 J 1 安徽農(nóng)業(yè)科學,2006, 34 (8) : 1625 - 162614.2 光學型生物傳感器光學型生物傳感器主要由光纖和生物敏感膜組成。 由敏感膜中生物活性成分對待測組分進行選擇性的分子識別，然后再通過換能反應(yīng)，把生物量轉(zhuǎn)化為各種光信息，如熒光、磷光、拉曼光、化學發(fā)光和生物發(fā)光輸出。 它克服了化學發(fā)光分析選擇性差的不足，兼有化學發(fā)光分析的靈敏性和酶法分析的專屬性。 具有探頭直徑小、信息傳遞容量大、能量損耗低和抗干擾能力強等優(yōu)點。Tschmelak23描述了一種自動化的光學免疫傳感器，它利用全內(nèi)反射熒光設(shè)備(TIRF

18、)來測量水樣中的抗生素、農(nóng)藥等有機化合物含量。 全內(nèi)反射熒光的原理是當入射光從光密介質(zhì)(折射率n)進入光疏介質(zhì)(折射率n)時，在界面上會同時發(fā)生反射和折射，其規(guī)律遵循折射定律：n1sinqi=n2sinqt，并且存在一個臨界角qc=arcsin(n2/n1)，當入射角大于qc 時，所有的入射光能全部反射回光密介質(zhì)，即發(fā)生了全內(nèi)反射。 此時少部分電磁輻射將穿過界面滲透到光疏介質(zhì)沿界面?zhèn)鞑?，這部分能量就稱為“倏逝波(損耗波，消失波)”。 在界面產(chǎn)生的特定的倏逝波可以激發(fā)界面附近的分子，使其產(chǎn)生熒光，即所謂的全內(nèi)反射熒光。 它具有高度的界面特異性，可有效排除本體干擾，獲取界面信息。 全內(nèi)反射熒光法相

19、對簡單，靈敏度達到毫微克/升，不需要費時而達到足夠的靈敏度。 可以用來作環(huán)境監(jiān)測和預警。5 其它檢測技術(shù)在一些發(fā)達的國家，用實驗室機器人進行農(nóng)藥殘留分析目前正處于起步階段，但測試手段和操作程序尚不成熟。 因此研制方便、靈活、運行速度快、體積小的實驗室機器人，制定標準化的實驗方法，將是未來的現(xiàn)代化實驗室的一個發(fā)展方向化學速測法在農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)方面的研究進展目前 農(nóng)藥殘留的化學快速檢測技術(shù)研究主要是根據(jù)有機磷農(nóng)藥的氧化還原特性! 有機磷農(nóng)藥磷酸酯# 二硫代酸酯# 磷酰胺#在金屬催化劑作用下水解為磷酸與醇 水解產(chǎn)物與檢測液反應(yīng) 使檢測液的紫紅色褪去變成無色$%&! 本方法的特點是避免了使用酶的

20、不穩(wěn)定# 不易保存 但該方法局限于有機磷靈敏度不高 易受一些還原性物質(zhì)干擾! 酶抑制技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)方面的研究進展酶抑制技術(shù)是研究比較成熟# 應(yīng)用最廣泛快速的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù) 是根據(jù)有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶()*+#的特異性生化反應(yīng)建立起來的農(nóng)藥殘留的微量和痕量快速檢測技術(shù)$!&! 國內(nèi)外近幾年對選用酶的種類# 底物和檢測方法做了大量的研究!,% 碘代硫化乙酰膽堿為底物 -./0為顯色劑 根據(jù)顏色的變化測定酶的活性有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制了()*+的活性 引起碘代硫化乙酰膽堿不能水解 造成積累利用碘代硫化乙酰膽堿與121!3二硫代3!2!3二硝基苯甲酸-./04反應(yīng)

21、生成黃色的13巰基3!3硝基苯甲酸測定其吸光度即抑制率 確定酶的活性 根據(jù)酶的活性估算農(nóng)藥殘留量! 目前國內(nèi)大多農(nóng)藥速測儀都是利用顏色的變化吸光度4原理研究設(shè)計 如福建省測試技術(shù)研究所研制出便攜式農(nóng)藥殘留速測儀用于農(nóng)藥殘留的檢測# 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所設(shè)計的農(nóng)藥速測儀# 廈門歐達科儀公司生產(chǎn)的速測儀# 上海光電技術(shù)研究所設(shè)計的農(nóng)藥殘留儀等! 不同公司研制的儀器大同小異 只是在酶和底物應(yīng)用方面存在細微的區(qū)別 從而判定的抑制率也存在差異! 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所選用的是丁酰膽堿酯酶 上海光電技術(shù)研究所和廈門歐達科儀公司等選用乙酰膽堿酯酶!,! 氯化乙酰膽堿在肌堿酯酶作用下 產(chǎn)生酸 根據(jù)56的變化測定酶的活性

22、當有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在時()*+活性受到抑制 氯化乙酰膽堿在()*+作用下產(chǎn)生的乙酸量也相應(yīng)減少 影響56值 通過測定56的變化 測定乙酰膽堿酯酶受抑制的程度 從而檢測出蔬菜中農(nóng)藥殘留量!, 植物酯酶水解!27二氯乙酰錠酚 根據(jù)反應(yīng)溶液反應(yīng)前后顏色的變化 測定酶的活性$&酶可以催化!27二氯乙酰錠酚分解產(chǎn)生蘭色靛酚當有機磷農(nóng)藥存在時 抑制了酶的活性 導致樣品溶液呈淺蘭色或橙色不變 根據(jù)與對照溶液比較確定樣品中是否含有有機磷農(nóng)藥! 浙江# 廣州# 深圳等地研制出乙酰膽堿酯酶速測卡$1&# 速測箱用于定性檢測大多是根據(jù)酶催化!27二氯乙酰錠酚產(chǎn)生蘭色靛酚的量進行比色確定抑制率!其它的技

23、術(shù)還有如乙酰萘酯為底物的等原理的速測技術(shù)!酶制技術(shù)檢測農(nóng)藥殘留操作簡便# 快速# 靈敏# 經(jīng)濟 樣品無需凈化 但是此方法不能定性定量 在檢測韭菜# 生姜# 蔥# 蒜# 胡蘿卜# 辣椒# 西紅柿等蔬菜容易受到干擾 只能作為有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的初篩! 隨著研究的深入 酶抑制技術(shù)檢測農(nóng)藥殘留在檢測方法上也有較大的突破除、 檢測時間在%9=%9?A 應(yīng)用前景廣闊!B 免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留快速檢測方面的進展免疫分析技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)方面的有放射免疫分析CD(4和酶免疫分析+D(4! 目前酶免疫分析技術(shù)尤其是酶聯(lián)免疫分析+DE(4在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用研究在國外非常活躍 應(yīng)用也日趨普遍

24、$F3G&! 酶免疫技術(shù)分析主要是基于抗原和抗體特異性識別和結(jié)合反應(yīng)的分析方法! 大分子量的農(nóng)藥可以直接作為抗原免疫動物產(chǎn)生抗體 小分子量H!1994的農(nóng)藥屬于半抗原 一般不具有免疫原性不能直接免疫動物產(chǎn)生抗體 因而小分子量的農(nóng)藥一般要與分子量大的載體偶聯(lián) 制備人工抗原 以檢測技術(shù)! 、梁祈，魏雪芳.中藥材黃芪中有機氮農(nóng)藥殘留量的液相色譜檢測方法J.分析測試學報，2000，（3）綜上所述中國的農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測尚處于起步階段，檢測方法標準的制定工作還滯后于農(nóng)產(chǎn)品市場發(fā)展的需要。今后應(yīng)加快檢測標準的制定，盡快研究出適合中國國情的多殘留檢測方法，加強技術(shù)培訓，并以較低的成本普及到生產(chǎn)和銷售領(lǐng)域中去，為提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量做出應(yīng)有的貢獻。參考文獻1 李艷霞, 張保東. 農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究J. 周口師范學院學報,2005, 22(5): 79-82.2 HOLGER S, SANDRA V, FRANCOIS V, et al. Design ofacetylcholinesterases for biosensor applicationsJ. Biosensors andBioelectronics, 2003, 18: 201-209.3 LAROSA C, PARI