1、1,緒 論,第五章 細(xì)胞培養(yǎng)與 次生產(chǎn)物生產(chǎn),第四章 植物主要 組織培養(yǎng)技術(shù),第八章 人工種子,第六章 原生質(zhì)體培養(yǎng),第二章 細(xì)胞全能性 與形態(tài)發(fā)生,第七章 體細(xì)胞雜交,第一章 基本技術(shù),第九章 種質(zhì)貯藏,第十章 動物細(xì)胞工程,第三章 體細(xì)胞 遺傳變異,2,第二章 細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生,細(xì)胞全能性及其表達(dá),器官發(fā)生,體細(xì)胞胚胎發(fā)生,3,第一節(jié) 細(xì)胞全能性及其表達(dá),細(xì)胞全能性概述,細(xì)胞脫分化,細(xì)胞再分化,4,一個細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有能力稱之為細(xì)胞的全能性。 細(xì)胞全能性的絕對性與相對性: 不是所有基因型的所有細(xì)胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng); 即使對于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞全能性也并

2、不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物個體; 動、植物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。,一. 細(xì)胞全能性概述,5,植物細(xì)胞按照分裂能力分為三類： 第一類是始終保持分裂能力，從一個周期進(jìn)入另一個周期的周期細(xì)胞。如莖尖、根尖及形成層細(xì)胞； 第二類是永久失去分裂能力的細(xì)胞，為終端分化細(xì)胞。如篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞； 第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂的G0細(xì)胞。表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞。,6,一個植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。,不同類型植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)可能進(jìn)行的程度趨勢,營養(yǎng)生長中心,形成層,薄壁細(xì)胞,厚壁

3、細(xì)胞,退化細(xì)胞,7,植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱: 營養(yǎng)生長中心 形成層 薄壁細(xì)胞 厚壁細(xì)胞(木質(zhì)化細(xì)胞) 特化細(xì)胞(篩管、導(dǎo)管細(xì)胞)； 根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱為： 頂端分生組織 居間分生組織 側(cè)生分生組織 薄壁組織(基本組織) 厚角組織 輸導(dǎo)組織 厚壁組織。,8,細(xì)胞全能性,脫分化,再分化,細(xì)胞分裂,個體再生,細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。,9,二. 細(xì) 胞 脫 分 化,細(xì)胞生理與結(jié)構(gòu)變化,細(xì)胞脫分化調(diào)控機(jī)理,細(xì)胞分裂與愈傷組織形成,10,培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到

4、原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程就是細(xì)胞脫分化（dedifferentiation）。 離體培養(yǎng)下，脫分化過程發(fā)生在第一次有絲分裂之前 。 靜止細(xì)胞啟動分裂是分化細(xì)胞成功脫分化的重要標(biāo)志。,細(xì)胞脫分化過程中生理和結(jié)構(gòu)變化,11,薄壁細(xì)胞： 細(xì)胞核較小，核位于細(xì)胞邊緣，細(xì)胞中央有大的液泡，細(xì)胞體內(nèi)核糖體密度較低，多聚核糖體數(shù)目較少，質(zhì)體為分化程度較高的葉綠體、雜色體、白色體和淀粉體。,脫分化細(xì)胞： 細(xì)胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐漸移位至細(xì)胞中央，細(xì)胞器增加。在這些變化中，液泡蛋白體的出現(xiàn)和質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體被認(rèn)為是細(xì)胞脫分化的重要特征。,12,根據(jù)脫分化細(xì)胞過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的時

5、空順序，細(xì)胞的脫分化過程可分為3個階段： 第一階段為啟動階段，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)增生，并開始向細(xì)胞中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)； 第二階段為演變階段，此時細(xì)胞核開始向中央移動，質(zhì)體演變成原質(zhì)體； 第三階段為脫分化終結(jié)期，細(xì)胞回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞分裂即將開始。,13,細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理,細(xì)胞周期對脫分化的調(diào)控,激素誘導(dǎo)表達(dá)基因與細(xì)胞脫分化,促分裂肽的發(fā)現(xiàn)及其對細(xì)胞脫分化的影響,細(xì)胞脫分化與染色體解凝聚,14,細(xì)胞脫分化調(diào)控的實質(zhì)即是G0期細(xì)胞回復(fù)到分裂周期的調(diào)控過程 20世紀(jì)70年代，研究者發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞G1期中，存在有特定的調(diào)控點，稱為“限制點”（R point）。在這個點之前，如果缺

6、少外界生長信號（通常是肽生長因子）或某些必需的營養(yǎng)成分（如必需氨基酸），細(xì)胞會終止其G1期的進(jìn)程，進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)稱為G0期，一旦補充了所缺少的因子之后，細(xì)胞即會從G0期回到G1期繼續(xù)分裂周期。,15,2001年度的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎獲得者，美國科學(xué)家Hartwell與英國科學(xué)家Hunt和Nurse的工作揭開了這一過程的調(diào)控機(jī)制。 細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDK cyclin-dependent kinase)是兩類主要的調(diào)控分子。細(xì)胞周期運行的動力主要來自CDK，其活性則主要通過cyclin調(diào)節(jié)和依賴周期蛋白抑制子（CKI cyclin-dependent kinase

7、 inhibitor）的負(fù)調(diào)節(jié)。,16,Cyclin,Cyclin,Cyclin,p34,CKI,CKI,p34,p34,p34,Cyclin-M,17,18,19,20,植物細(xì)胞周期的調(diào)控主要有2類CDK（CDKa、CDKb）和2類cyclin（CycB、CycD）。在環(huán)境或激素等外界條件作用下，CycD基因首先表達(dá)生成CycD，在相關(guān)調(diào)節(jié)因子的幫助下CycD與CDKa結(jié)合形成CDKa/CycD復(fù)合體使CDKa活化，進(jìn)而對Rb（G1期限制點調(diào)控分子）磷酸化，使細(xì)胞通過“限制點”進(jìn)入分裂周期。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂周期后，則由CDKb與CycB以及相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白完成從S期到M期的調(diào)控。,21,22,植

8、物激素是離體培養(yǎng)中所必需的條件，因此與植物激素相關(guān)的基因表達(dá)被認(rèn)為是啟動細(xì)胞脫分化的關(guān)鍵。 Takahashi等（1989）從一個葉肉原生質(zhì)體cDNA文庫中分離到一個2,4-D誘導(dǎo)表達(dá)的基因，命名為par (prostate apoptosis response)。par基因在細(xì)胞從G0期轉(zhuǎn)入S期的早期啟動中具有功能性作用。 Kyo等克隆了一組花粉富含硫蛋白(pollen-abundant phosphoproteins)基因(Nicotiana tabacum embryogenic pollen) NtEPa，NtEPb，NtEPc。其中NtEPc的表達(dá)與花粉細(xì)胞脫分化轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞高度偶

9、聯(lián)，認(rèn)為該基因參與花粉細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞脫分化的過程但不參與細(xì)胞進(jìn)入分裂周期后的調(diào)控過程。,23,現(xiàn)有研究證明，植物細(xì)胞感受生長素的信號是由生長素受體（auxin receptor）和生長素分子相結(jié)合，使生長素受體被活化而完成的，這一過程稱為生長素感應(yīng)(perception)。 激活的受體可能引起某些特定的反應(yīng)，如某些離子的吸收或釋放、特定蛋白的磷酸化或去磷酸化等，進(jìn)而引起一系列連鎖信號傳導(dǎo)反應(yīng)，最終導(dǎo)致生長素誘導(dǎo)的基因表達(dá)。,24,1996年，日本學(xué)者M(jìn)atsubyashi等從石刁柏培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液條件化培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)中發(fā)現(xiàn)了PSK，它可以促進(jìn)細(xì)胞的生長和增

10、殖。 植物磺肽素(phytosulfokine，簡寫PSK)是一種新型植物肽類生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。它是兩種短肽類物質(zhì)磺化的四肽(PSK-)或五肽(PSK-)，其結(jié)構(gòu)為 H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-OH 或 H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gln-OH,25,檢測分析發(fā)現(xiàn)，在同時有NAA和BA存在的條件下，第一次細(xì)胞分裂發(fā)生在培養(yǎng)96小時，而培養(yǎng)48小時即可檢測到PSK， 在培養(yǎng)基沒有NAA和BA的培養(yǎng)細(xì)胞中，檢測不到PSK的存在，同時細(xì)胞也停留在G0/G1期而不能啟動分裂，由此推測，PSK可能介導(dǎo)了與生長素和細(xì)胞分裂素密切相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑

11、,26,-萘乙酸 ，NAA C12H10O2 -Naphthaleneacetic Acid,6-芐胺基嘌呤,BA C12H11N5 6-Benzylaminopurine,27,進(jìn)一步研究表明，水稻細(xì)胞質(zhì)膜存在有PSK的蛋白質(zhì)受體，已分離的蛋白質(zhì)受體為120kD和160kD的膜蛋白。 煙草細(xì)胞純化的120kD蛋白為一受體激酶，含有一個胞外富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域和一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，與PSK高度親合，顯示PSK和120kD受體激酶是一活躍的配體受體對。過量表達(dá)受體蛋白基因，能顯著提高愈傷組織生長,28,煙草葉肉細(xì)胞脫分化過程中染色體有2次解凝聚過程。 第一次解凝聚發(fā)生在細(xì)胞壁酶解過程中 第二次解凝

12、聚發(fā)生在原生質(zhì)體在含有生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時 第二次解凝聚對于細(xì)胞進(jìn)入S期是十分重要的，發(fā)生二次解凝聚的細(xì)胞在培養(yǎng)72小時后即進(jìn)入S期，在不含植物激素的培養(yǎng)基中細(xì)胞，染色體不發(fā)生第二次解凝聚，以后迅速死亡。 第一次染色體解凝聚是細(xì)胞脫分化的轉(zhuǎn)換過程，通過此過程細(xì)胞關(guān)閉分化狀態(tài)，而第二次解凝聚則是有絲分裂周期銜接過程。,29,PI fluorescence,30,細(xì)胞脫分化與愈傷組織形成,細(xì)胞脫分化是細(xì)胞狀態(tài)的改變，但成功的脫分化必然會導(dǎo)致細(xì)胞分裂， 在一個細(xì)胞群體培養(yǎng)或組織器官培養(yǎng)體系中，有時很難區(qū)分細(xì)胞脫分化與進(jìn)入增殖狀態(tài)的界限。 對于單個細(xì)胞而言，分化細(xì)胞啟動分裂顯然

13、是發(fā)生在細(xì)胞完全脫分化之后 細(xì)胞初期分裂方式與外植體細(xì)胞類型有關(guān)，如果外植體細(xì)胞均為正常二倍體細(xì)胞，第一次分裂通常是有絲分裂，如果外植體含有高倍化細(xì)胞，脫分化的第一次分裂可能是無絲分裂。,31,器官，組織培養(yǎng)時細(xì)胞分裂首先發(fā)生在傷口部位,培養(yǎng)3天,培養(yǎng)5天,培養(yǎng)7天,32,脫分化與愈傷組織的形成在性質(zhì)上是不能等同的，脫分化是細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，而形成愈傷組織是離體培養(yǎng)中的一個階段。 盡管細(xì)胞脫分化后進(jìn)入細(xì)胞分裂的結(jié)果，在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但絕不是說所有的細(xì)胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織，許多試驗表明，有些外植體的細(xì)胞脫分化以后直接形成胚性細(xì)胞進(jìn)而形成體細(xì)胞胚。 愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞并不

14、是均一未分化的，即同一愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞之間其狀態(tài)存在一定差異，特別是在組織器官培養(yǎng)時，往往出現(xiàn)部分細(xì)胞不完全脫分化的現(xiàn)象，從而使其很容易再分化再生植株，這對培養(yǎng)來說無疑是十分有利的。,33,三. 細(xì) 胞 再 分 化,所謂細(xì)胞分化（Differentiation），是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。 一個細(xì)胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機(jī)能，這是在時間上的分化； 同一種細(xì)胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)和機(jī)能，這是在空間上的分化。,34,從分化的遺傳控制角度講，細(xì)胞分化是各個處于不同時空條件下的細(xì)胞，基因表達(dá)與修飾差異的反應(yīng)，所以，分化也可以說是

15、相同基因型的細(xì)胞由于基因選擇性表達(dá)所反應(yīng)的各種不同的表現(xiàn)型。 在離體條件下，當(dāng)細(xì)胞脫分化以后，無序生長的細(xì)胞及其愈傷組織要重新進(jìn)入有序生長進(jìn)而才能再生個體，因此，通常把離體培養(yǎng)下的這一過程稱為再分化（redifferentiation）。,35,細(xì)胞分化與基因組變化,TE分化及其調(diào)控,激素在細(xì)胞分化中的作用,極性與細(xì)胞分化,36,染色體的反復(fù)復(fù)制 DNA的差異擴(kuò)增 基因重排 基因表達(dá)產(chǎn)物及其調(diào)控與修飾是細(xì)胞分化的本質(zhì)所在。越來越多的研究顯示，細(xì)胞分化主要受基因在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，其中一些特異蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)在細(xì)胞分化過程中起到了重要作用,細(xì)胞分化中的基因組變化,37,極性（pola

16、rity）是植物細(xì)胞分化中的一個基本現(xiàn)象。 所謂極性是指植物的器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。 在很多情況下，細(xì)胞的不均等分裂是是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志。,極性與細(xì)胞分化,38,墨角藻(Fucus)合子細(xì)胞不均等分裂及其早期發(fā)育（引自Bouget等，1998）,極性建立與質(zhì)膜離子通道的不對稱分布和細(xì)胞周質(zhì)微管重排有關(guān),39,通常把離體培養(yǎng)中TE（TE tracheary elements,管狀分子）細(xì)胞的出現(xiàn)作為組織分化的標(biāo)志 而極性的建立似乎又是維管發(fā)生的一個信號，極性建立后生長素按極性方向流動，導(dǎo)致TE細(xì)胞分化 由于TE細(xì)胞在分化過程中具有細(xì)胞

17、壁加厚，原生質(zhì)體自溶等容易觀察的細(xì)胞特征，從而又為植物細(xì)胞分化研究提供了模式體系,TE的形成與細(xì)胞分化,40,百日草葉肉細(xì)胞向TE細(xì)胞分化的主要調(diào)控過程（引自Fukuda，1997）,41,由百日草葉肉細(xì)胞分化形成的TE細(xì)胞（引自Motose, 2001）,42,百日草葉肉細(xì)胞向TE分化過程中的基因表達(dá)分析 （引自Demura等，2002）,43,激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素，其中生長素和細(xì)胞分裂素是兩類主要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長和分化的植物激素。此外，在有些試驗中也顯示，GA3、ABA、乙烯等也在細(xì)胞分化中起到一定調(diào)節(jié)作用。,激素對細(xì)胞分化的調(diào)控作用,44,Gibb

18、erellic acid,GA3 C19H22O6 赤霉素,赤霉酸,920,Abscisic Acid,ABA C15H20O4 脫落酸;休眠酸; 脫落素;,45,Gibberellic acid,GA3 C19H22O6 赤霉素,赤霉酸,920,46,1949年，法國植物學(xué)家Camus，把一種菊苣小的營養(yǎng)芽嫁接在其根的組織培養(yǎng)物的上表面，幾天以后，處于芽下的薄壁細(xì)胞中分化出了維管束。這些維管束與芽的維管組織相接在一起。同時，他在愈傷組織表面放置一片玻璃紙，在玻璃紙上再放置芽，切段了愈傷組織與芽之間的直接接觸，結(jié)果維管組織的分化依然發(fā)生。這個試驗表明，芽對維管組織的分化有刺激作用，這種刺激作用

19、必然是由一種或幾種擴(kuò)散性的化學(xué)物質(zhì)引起的。,47,在眾多植物離體培養(yǎng)中證明，細(xì)胞分裂素和生長素對于細(xì)胞生長和分化具有同等重要的協(xié)同作用，它們的量與比值的不同配合，對細(xì)胞分化起著重要調(diào)節(jié)作用。,48,在離體條件下，如果用生長素和細(xì)胞分裂素處理的順序不同，其作用也不一樣。如果先用生長素處理，后用細(xì)胞分裂素處理，則有利于細(xì)胞分裂而不利于細(xì)胞分化；反之，則有利于細(xì)胞分化。如果兩者同時處理，則可促使分化頻率的提高。,49,Dominov等（1992）從一個煙草的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系中分離到一個同時可被生長素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)表達(dá)到cDNA pLS216 (原發(fā)性脾臟惡性淋巴瘤) 在誘導(dǎo)表達(dá)試驗中顯示，只加入生長

20、素（2,4-D）只引起mRNA短暫積累，而加入外源細(xì)胞分裂素（BA）引起的轉(zhuǎn)錄積累雖發(fā)生時間較遲，但可持續(xù)轉(zhuǎn)錄，因此他們也認(rèn)為細(xì)胞分裂素可能增加了細(xì)胞對生長素的敏感性，或者能阻斷生長素的反饋抑制。,50,另一個生長素誘導(dǎo)表達(dá)基因是p48h-10。在百日草葉肉細(xì)胞培養(yǎng)中，單獨使用IAA時，在培養(yǎng)48小時后才檢測到p48h-10的表達(dá)，而與BA同時使用時，培養(yǎng)24小時即可檢測到該基因地表達(dá)，只使用BA則不能啟動該基因地表達(dá)。 組織印跡顯示，p48h-10只在莖和根的維管束中表達(dá)，在分生組織中該基因不表達(dá)（Ye和Varner，1994）。這一結(jié)果較直接的證明了生長素與細(xì)胞分裂素在細(xì)胞分化中的協(xié)同調(diào)控

21、作用。,51,吲哚-3-乙酸 (IAA) C10H9NO2 Indole-3-aceticacid,2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) C8H6Cl2O3 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,52,除了生長素和細(xì)胞分裂素外，赤霉酸（GA）、乙烯（EL）、脫落酸（ABA）、油菜素內(nèi)酯（BR brassinosteroid） 等植物激素在細(xì)胞分化中的作用也有報道。 越來越多的研究顯示，植物激素對細(xì)胞生長與分化的調(diào)控是一個復(fù)雜的級聯(lián)調(diào)控過程，離體培養(yǎng)條件下，由于外植體細(xì)胞所處的生理狀態(tài)不同以及內(nèi)源激素水平的差異，試圖尋找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困難的。,5

22、3,油菜素內(nèi)酯;蕓苔素內(nèi)酯;24-表-蕓苔素內(nèi)酯; 2,3,22R,23-S-四羥基-21R-甲基-高-7-氧雜-5膽甾烷-6酮; C28H48O6 BR (brassinolide;Brassins;Brassinosteroid;R-epibrassinolide),54,細(xì)胞脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細(xì)胞全能性表現(xiàn)的基本過程，了解這一過程的調(diào)控機(jī)理，最終是為再生個體奠定基礎(chǔ)。 生物個體形成是通過形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）實現(xiàn)的，建立在離體培養(yǎng)基礎(chǔ)上的形態(tài)發(fā)生稱之為體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生（somatic morphogenesis）。體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生過程及其調(diào)控機(jī)理是細(xì)胞工程學(xué)研究的

23、核心內(nèi)容。,55,第二節(jié) 器官發(fā)生,植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器官的過程。,56,器官發(fā)生方式,器官發(fā)生過程,起始材料 對器官分化 的影響,激素對器官 分化的調(diào)控,光照對器官分化的影響,器官分化的基因調(diào)控,57,器官發(fā)生方式,58,經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生,不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生,器官發(fā)生過程,59,經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程,愈傷組織形成,生長中心形成,器官原基及器官形成,60,愈傷組織形成,61,生長中心形成,62,芽形成,63,64,不經(jīng)過愈傷組織的器

24、官發(fā)生,在有些情況下，外植體不經(jīng)過典型的愈傷組織即可形成器官原基，這一途徑有兩種情況： 一是外植體中已存在器官原基，進(jìn)一步培養(yǎng)即形成相應(yīng)組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)。 另一種情況是外植體某些部位的細(xì)胞在重新分裂后，直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。 這種不經(jīng)過愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的實踐意義。,65,莖尖培養(yǎng)中芽形成,外植體直接 發(fā)生芽,66,67,外植體的類型,母體植物的遺傳基礎(chǔ),起始材料對器官分化的影響,68,總體上說，被子植物比裸子植物容易培養(yǎng)，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培養(yǎng)

25、成功的報道最多。通常情況下，自然繁殖以無性繁殖為主的植物在培養(yǎng)條件下也有較強(qiáng)的器官分化的能力 同種植物不同品種（基因型）的培養(yǎng)效果具有較大差異已是不爭的事實。 基因型對于培養(yǎng)反應(yīng)的差異，器官分化能力的差異大于愈傷組織誘導(dǎo)的差異。,69,不同基因型大豆上胚軸器官分化能力,70,玉米不同自交系幼胚培養(yǎng)器官分化能力,71,外植體對誘導(dǎo)反應(yīng)及其再生能力的影響體還現(xiàn)在生理狀態(tài)上 來源于生長活躍或生長潛力大的組織、器官的細(xì)胞更有利于培養(yǎng) 對于多年生植物而言，以幼嫩組織為材料無論是誘導(dǎo)還是分化均較容易。 一、二年生無性繁殖植物的取材則可塑性較大，但仍以自然繁殖器官為外植體更易成功。,72,外植體選取合理與否

26、，不僅影響培養(yǎng)的難易，而且有時甚至影響分化的程度和器官類型。,花芽,營養(yǎng)芽，花芽,營養(yǎng)芽,Tran Thanh Van等 ，1974,73,激素對器官發(fā)生的影響,離體培養(yǎng)下的器官分化在大多數(shù)情況下是通過外源提供適宜的植物激素而實現(xiàn)的。在眾多的植物激素中，生長素與細(xì)胞分裂素是2類主要的植物激素，在離體器官分化調(diào)控中占有主導(dǎo)地位。 GA3, PSK在器官分化中也具有一定調(diào)控作用。,74,生長素/細(xì)胞分裂素高 有利于根分化 生長素/細(xì)胞分裂素低 有利于芽分化 生長素與細(xì)胞分裂素必須協(xié)調(diào)使用才能再生正常個體,75,離體培養(yǎng)中，外源激素在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝影響到激素的活性從而影響其培養(yǎng)效果。外源細(xì)胞分裂

27、素被外植體吸收后，在細(xì)胞內(nèi)被修飾和轉(zhuǎn)化形成活化形式和鈍化形式。一般認(rèn)為，細(xì)胞分裂素自由堿基形式是活性形式，而核苷形式為鈍化形式。 通過細(xì)胞分裂素氧化酶對側(cè)鏈的修飾可能是植物組織細(xì)胞中降低細(xì)胞分裂素活性的主要機(jī)制，在煙草細(xì)胞培養(yǎng)中使用二氫玉米素比使用玉米素更為有效，可能與二氫玉米素核糖苷不是細(xì)胞分裂素氧化酶的底物有關(guān)。,76,生長素進(jìn)入細(xì)胞后，一部分以游離狀態(tài)存在，另一部分則與氨基酸結(jié)合形成生長素氨基酸復(fù)合體。 與生長素結(jié)合的氨基酸主要為天門冬氨酸，也有谷氨酸。2,4-D、NAA、IAA是常用的3種生長素，。Ribnicky等（1996）的研究顯示，由于生長素種類不同，形成生長素-氨基酸復(fù)合體的

28、量具有顯著差異，從而亦表現(xiàn)出作為外源生長素在培養(yǎng)效果上的差異。,77,外源生長素在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)細(xì)胞中的總量和游離生長素含量*,* 引自Ribnicky等1996。,78,光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子，光照時間、強(qiáng)度以及光質(zhì)隊器官分化均有影響。,光照對器官分化的影響,79,連續(xù)的光照有利于培養(yǎng)細(xì)胞維管組織的形成，而一定的晝夜光照周期則有利于極性建立和形態(tài)發(fā)生。 培養(yǎng)條件下，光照的作用更大程度上是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。 光照對器官發(fā)生的調(diào)節(jié)可能與調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的內(nèi)源激素平衡有關(guān)，光照還可能影響生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)整生長素的極性運輸，從而引起器官分化。 光質(zhì)對器官分化的影

29、響可能與光受體精確調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)。,80,基因調(diào)控,homebox,細(xì)胞周期基因,其它,81,Kn1（KNOTTED1）是從玉米中鑒定出的第一個植物homebox基因，Kn1-like homebox（knox）基因又可分為2組（classI和classII），classII knox在各種分化組織器官中均表達(dá)，而class I knox只在分生組織中表達(dá)。在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，大量不定芽生成的部位也檢測到Kn1基因的大量表達(dá)。在一些轉(zhuǎn)Kn1相似基因地研究中表明，轉(zhuǎn)基因植株能大量產(chǎn)生復(fù)合芽以及不定分生組織。 STM（SHOOTMERISTEMLESS）基因以及它們的直系同源（orthologu

30、es）基因均參與了莖尖分生組織的分化調(diào)控。 在轉(zhuǎn)Homeobox相關(guān)基因的煙草植物中還檢測分析到赤霉素含量減少和生長素含量上升的內(nèi)源激素變化，這也暗示，Homeobox基因可能通過一些調(diào)節(jié)因子（如激素）介導(dǎo)調(diào)控器官分化。,82,植物編碼細(xì)胞周期依賴性激酶基因cdc2在離體培養(yǎng)中，調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入分裂狀態(tài)的過程起著關(guān)鍵性作用，在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，cdc2的表達(dá)高峰發(fā)生在不定芽形成的過程中，在培養(yǎng)初期的表達(dá)量較少，同時，該基因的表達(dá)部位處于分生組織的外層細(xì)胞，因此認(rèn)為，cdc2基因?qū)Ψ稚M織的形成和維持分生組織狀態(tài)均有重要作用。,83,Banno等（2001）從擬南芥根培養(yǎng)再生芽的體系中克隆了一個

31、增強(qiáng)芽再生能力的基因ESR1，將該基因與35S啟動子連接轉(zhuǎn)化擬南芥，在有細(xì)胞分裂素存在的情況下轉(zhuǎn)基因外植體可以顯著提高不定芽的分化率。而生長素不能誘導(dǎo)該基因表達(dá)，同樣也不能提高不定芽分化頻率。,84,從煙草溫度突變體中鑒定出3個與離體器官發(fā)生有關(guān)的基因SRD1、SRD2和SRD3，當(dāng)它們發(fā)生隱形突變時，在離體培養(yǎng)中表現(xiàn)出器官發(fā)生在不同時期受阻，3個基因均定位于擬南芥I號染色體上。,85,Low等（2001）通過RT-PCR技術(shù)克隆了一個含有亮氨酸拉練基因bZIP（PKSF1），該基因編碼一個亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)發(fā)生在芽形成之前，在有不定芽形成的愈傷組織中其表達(dá)量比非分化愈傷組織高6倍,8

32、6,第三節(jié) 體細(xì)胞胚胎發(fā)生,離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。 這一定義有以下幾方面的界定： 其一，體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無融合生殖胚； 其二，體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚； 其三，體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)別與離體培中器官發(fā)生形成個體的途徑。,87,體細(xì)胞胚的形成,體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點,影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素,體細(xì)胞胚發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ),88,一. 體細(xì)胞胚的形成,89,體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生,1.誘導(dǎo)階段,2. 胚胎發(fā)育階段,90,經(jīng)

33、過愈傷組織的體細(xì)胞胚形成,經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成,間接發(fā)生,91,誘導(dǎo)愈傷組織形成,愈傷組織胚性化,球性胚形成,子葉胚期,92,93,體細(xì)胞胚發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特點,體細(xì)胞胚的結(jié)構(gòu)特點,二. 體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點,94,類似于植物合子胚的發(fā)育,95,類似于動物胚胎早期的發(fā)育,96,結(jié) 構(gòu) 特 點,與器官發(fā)生形成個體的途徑相比，體細(xì)胞胚發(fā)育再生植株有兩個明顯的特點： 一是體細(xì)胞胚具有雙極性（doulble polarity）； 二是體細(xì)胞胚形成后與母體的維管束系統(tǒng)連系較少，即出現(xiàn)所謂的生理隔離（physiological isolation）現(xiàn)象。,97,與合子胚比較： 合子胚在發(fā)育初期具有明

34、顯的胚柄，而體細(xì)胞胚一般沒有真正的胚柄只有類似胚柄的結(jié)構(gòu)。 合子胚的子葉是相當(dāng)規(guī)范的，可以作為分類的依據(jù)，體細(xì)胞胚的子葉常不規(guī)范。 與相同植物比較體細(xì)胞胚的體積明顯小于合子胚，在一些貯藏物質(zhì)的含量上也存在較大差異。并且，體細(xì)胞胚不能有明顯的脫水干燥過程。 合子胚在胚胎發(fā)育完全進(jìn)入子葉期胚以后，經(jīng)過一系列的物質(zhì)積累和脫水就進(jìn)入休眠，而體細(xì)胞胚則直接形成植株，在不同的培養(yǎng)條件和植株種類中，形成植株的胚胎時期有所不同，一般在心形期以后的各個階段均可直接發(fā)育成小植株。,98,三. 影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素,激素的調(diào)控作用,培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的影響,基因型的影響,99,2,4-D是應(yīng)用最為廣泛的生長素。2,

35、4-D的應(yīng)用有著規(guī)律性的變化，首先是在較高濃度下誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成，然后在降低2,4-D的濃度下產(chǎn)生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生長素有利于體細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育。 現(xiàn)有研究證明，在球形胚期形成的生長素極性運輸對于體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育尤為重要，如果球形胚阻斷生長素的極性運輸或改變生長素的極性運輸方向，均會影響體細(xì)胞胚的正常發(fā)育。,激素的調(diào)控作用,100,細(xì)胞分裂素對體細(xì)胞胚發(fā)育的影響研究報道較少，但幾乎所有的有關(guān)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)基配方中，均有細(xì)胞分裂素的配合使用。細(xì)胞分裂素在促進(jìn)細(xì)胞分裂，維持細(xì)胞活躍生長中具有重要生理功能，而完成體細(xì)胞胚胎發(fā)育細(xì)胞分裂是基本前體，當(dāng)胚胎結(jié)構(gòu)建立后，細(xì)胞分

36、裂素對于維持分生組織正常發(fā)育具有重要作用。,101,培養(yǎng)基中的氮源亦會顯著影響離體條件下的胚胎發(fā)生，據(jù)Halperin和Wetherell的報道，體細(xì)胞胚的產(chǎn)生要求培養(yǎng)基中含有一定濃度的還原態(tài)氮。 Vesco和Guerra在Feijoa(非油果,鳳榴)植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的試驗也證明，培養(yǎng)基氮源影響體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率。在NH4+和NO3-(1534)的培養(yǎng)基中，每個外植體的體細(xì)胞胚可達(dá)10個以上，而培養(yǎng)基只有NH4+或NO3-時，體細(xì)胞胚發(fā)生頻率很低。 一些氨基酸可以代替還原態(tài)氮的作用，上述Feijoa植物的體細(xì)胞胚培養(yǎng)體系，在只含NO3-的培養(yǎng)基中，如果加入4mM的甘氨酸，可以顯著提高體細(xì)胞胚的

37、發(fā)生頻率。,培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的影響,102,一些體細(xì)胞胚規(guī)模生產(chǎn)模式的試驗還發(fā)現(xiàn)，球形胚形成后，如果降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可以顯著促進(jìn)體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育。 Choi等（2002）在西伯利亞人參（E. senticosus）培養(yǎng)中證明，在體細(xì)胞胚培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可顯著提高體細(xì)胞胚的成苗率。 在一些試驗中還發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚發(fā)育后期降低蔗糖濃度，也有利于胚的繼續(xù)發(fā)育和提高體細(xì)胞胚的成苗率。,103,Lee等（2001）在改進(jìn)胡蘿卜體細(xì)胞胚生產(chǎn)程序的試驗中，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入減少濃度的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，結(jié)果顯示，當(dāng)胚性愈傷組織形成后，在只含1/2MS無機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基中，體細(xì)胞

38、胚形成可以比在MS培養(yǎng)基中高3-4倍。,104,Choi等（2002）在西伯利亞人參(E. senticosus)培養(yǎng)中也證明，在體細(xì)胞胚培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可顯著提高體細(xì)胞胚的成苗率。,105,馬鈴薯不同基因型體細(xì)胞胚形成能力比較,基因型的影響,106,內(nèi)源激素,調(diào)控基因,特異蛋白,四. 體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ),107,外源生長素的對體細(xì)胞胚產(chǎn)生和發(fā)育的調(diào)控是通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的合成、代謝、極性運輸和平衡而起作用的。 Ribnicky等在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)中證明，體細(xì)胞胚形成初期細(xì)胞內(nèi)具有較高濃度的游離態(tài)生長素，外源2,4-D和NAA比IAA誘導(dǎo)體細(xì)胞胚效果好，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)初

39、期，細(xì)胞內(nèi)高濃度的游離生長素是必要條件，直接添加外源IAA對其合成有反饋抑制，從而也影響體細(xì)胞胚的形成，而2,4-D對IAA的合成不存在反饋抑制，其結(jié)果也提高了體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率。 水稻胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)也證明，高濃度的2,4-D引誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)IAA含量升高，當(dāng)加入外源IAA或阻止細(xì)胞內(nèi)IAA滲出而提高細(xì)胞內(nèi)IAA含量時，均可促進(jìn)胚性愈傷組織形成。,內(nèi)源激素,108,胡蘿卜胚發(fā)育過程中內(nèi)源IAA的變化,內(nèi)源激素,109,生長素不僅影響體細(xì)胞胚的早期發(fā)生，同時也影響體細(xì)胞胚的后期發(fā)育。生長素對體細(xì)胞胚后期發(fā)育的影響是通過極性運輸實現(xiàn)的。 在合子胚的發(fā)育中，這種極性運輸嚴(yán)重影響胚形態(tài)的建立。Liu等（1993）利用擬南芥幼胚培養(yǎng)體系，揭示了生長素極性運輸由球形胚期得軸向?qū)ΨQ轉(zhuǎn)向心形胚期的兩側(cè)對稱的過程，如果這一過程受阻，則導(dǎo)致子葉異常發(fā)育成筒狀子葉，而不是正常的2個子葉。 在生長素極性運輸突變體pin1中證實了上述結(jié)果，已克隆的pin同源基因研究顯示，生長素的極