1、質(zhì)譜分析法藥品質(zhì)量控制中的應(yīng)用,2011年華東六省一市藥物分析交流會 李曉東 2011-10-18，濟南,提綱,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,二、質(zhì)譜法在藥品質(zhì)量控制中的應(yīng)用,三、質(zhì)譜法應(yīng)用展望,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,質(zhì)譜法（Mass Spectrometry）, 通過將被測物質(zhì)原子或分子離子化，利用電磁學(xué)原理，對荷電粒子或碎片粒子依其質(zhì)量和電荷的比值（質(zhì)荷比，m/z）進(jìn)行分離和分析，以達(dá)到確認(rèn)其元素組成及分子結(jié)構(gòu)的目的。,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,質(zhì)譜法的特點,質(zhì)譜不屬波譜范圍，質(zhì)譜圖與電磁波的波長和分子內(nèi) 某種物理量的改變無關(guān)。,質(zhì)譜是分子離子及碎片離子的質(zhì)量與其相對強度的 譜, 譜圖與分

2、子結(jié)構(gòu)有關(guān)。,質(zhì)譜法進(jìn)樣量少, 靈敏, 快速，特異，化學(xué)計量 （Sensitivity，Speed，Specificity，Stoichiometry）,質(zhì)譜是唯一可以給出分子量, 確定分子式的方法, 而 分子式的確定對化合物的結(jié)構(gòu)鑒定是至關(guān)重要的。,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,因質(zhì)譜技術(shù)獲諾貝爾獎的五位科學(xué)家,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,MS：Mass Spectrometry, Mass Spectrometer,質(zhì)譜儀的分類： (1) 有機質(zhì)譜儀： - 氣質(zhì)聯(lián)用，液質(zhì)聯(lián)用，傅立葉質(zhì)譜儀，激光解吸 飛行時間質(zhì)譜儀,(2) 無機質(zhì)譜儀 - 電感耦合等離子體質(zhì)譜, 同位素質(zhì)譜儀，二次 離子質(zhì)譜,氦

3、質(zhì)譜檢漏儀,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,質(zhì)譜儀分析標(biāo)準(zhǔn)程序： （1）樣品的導(dǎo)入 （2）樣品的離子化 （3）被測離子進(jìn)入電場或磁場 （4）離子按質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行分析 （5）按質(zhì)荷比m/z.進(jìn)行檢測,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,質(zhì)譜圖,以荷質(zhì)比m/z為橫座標(biāo)，以對基峰(最強離子峰，規(guī)定相對強度為100%)相對強度為縱座標(biāo)所構(gòu)成的譜圖。,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,質(zhì)譜圖,有機質(zhì)譜圖,無機質(zhì)譜圖,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,同位素質(zhì)譜圖,氯苯質(zhì)譜圖,溴丙烷質(zhì)譜圖,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,質(zhì)譜圖,質(zhì)譜在有機結(jié)構(gòu)分析上的應(yīng)用主要有兩方面： 確定相對分子質(zhì)量和分子式； 在低分辨質(zhì)譜中，由分子結(jié)構(gòu)與裂解方式的

4、經(jīng)驗規(guī)律，鑒定某些官能團(tuán)，給出分子的結(jié)構(gòu)信息； 定量模式：GC/MS SIM LC/MS/MS SIM or MRM ICP/MS SIM,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,* 2005版起中國藥典二部附錄收載質(zhì)譜法,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,* 實現(xiàn)質(zhì)譜技術(shù)的關(guān)鍵-高真空, 離子源和質(zhì)量分析器的壓力在 104 105 Pa和105 106 Pa 或10-610-7mmHg和10-710-8mmHg * 儀器類型：機械泵+渦輪分子泵,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,* 實現(xiàn)質(zhì)譜技術(shù)的關(guān)鍵-高真空,-質(zhì)譜是檢測帶電粒子,帶電粒子在電磁場的作用下，加速運動。如果有空氣，帶電粒子可能和空氣中的其他分子發(fā)生碰撞，使

5、離子很快淬滅而達(dá)不到檢測器，并引起額外的離子分子反應(yīng)，改變裂解模型，譜圖復(fù)雜化，影響分離及檢測。,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,* 氣質(zhì)聯(lián)用,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,* 液質(zhì)聯(lián)用,單四極桿和串聯(lián)質(zhì)譜。,空間串聯(lián)：QQQ、Q-Trap、Q-TOF、TOF-TOF,時間串聯(lián)：Ion Trap、Orbitrap、FT-MS,ESI APCI,- API是液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀最常用的離子化方式。,一、質(zhì)譜儀器的原理及分類,* 電感耦合等離子體質(zhì)譜,四極桿，雙聚焦、飛行時間質(zhì)譜,* 電感耦合等離子體質(zhì)譜,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,* 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,* 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,* 電感耦合等離子體

6、質(zhì)譜：可進(jìn)行定性、半定量、定量分析及同位素比值的準(zhǔn)確測量，還可與其他技術(shù)如HPLC、HPCE、GC聯(lián)用進(jìn)行元素的形態(tài)、分布特性等的分析，廣泛應(yīng)用于環(huán)境、半導(dǎo)體、醫(yī)學(xué)、生物、冶金、石油、核材料分析等領(lǐng)域。,* 氣質(zhì)聯(lián)用：靈敏度高，適合于低分子化合物（分子量1000）分析，尤其適合于揮發(fā)性成分的分析。廣泛應(yīng)用在中藥揮發(fā)性成分的鑒定、食品和中藥中農(nóng)藥殘留量的測定、體育競賽興奮劑等違禁藥品的檢測以及環(huán)境監(jiān)測等方面。,* 液質(zhì)聯(lián)用：目標(biāo)化合物的定性及定量分析，廣泛應(yīng)用在生化分析、天然產(chǎn)物分析、藥物和保健食品分析以及環(huán)境污染物分析等領(lǐng)域。,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,ICP-MS在進(jìn)樣過程中樣品狀態(tài)變化

7、如下：,溶液 -氣溶膠 -固體顆粒 -氣體分子 -原子 -離子,汽化 去溶劑化 氣化 原子化 離子化,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,ICP-MS檢測限及質(zhì)量分析范圍,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,市場上金屬元素分析儀器對比,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,根據(jù)溶液的濃度舉例如下，供參考： 每個樣品測定1-3個元素，元素濃度為亞或低于ppb級，如果被測元素要求能滿足的情況下，G-AAS是最合適的。 每個樣品5-20個元素，含量為亞ppm至%，ICP-AES是最合適的。 每個樣品需測4個以上的元素，在亞ppb及ppb含量，而且樣品的量也相當(dāng)大，ICP-MS是較合適的。,電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，ICP

8、-MS,（1） 在中藥材及中藥注射劑檢驗中的應(yīng)用 阿膠，白芍，丹參，甘草，枸杞子，黃芪，金銀花，山楂，西洋參 人參總皂苷，人參莖葉總皂苷，薄荷腦，燈盞花素，茵陳提取物， 三七總皂苷，共15個品種 -鉛不得過百萬分之五；鎘不得過千萬分之三；砷不得過百萬分之二；汞不得過千萬分之二；銅不得過百萬分之二十。,（2） 在制品分析中的應(yīng)用 - Al、Ni、Pd等過程代入的金屬元素,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（1） 在化妝品檢驗中的應(yīng)用,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，GC/MS,（2） 在塑化劑檢驗中的應(yīng)用,（3） 在農(nóng)藥殘留檢驗中的應(yīng)用,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（1） 在化妝品檢驗中的應(yīng)用 - 風(fēng)險及限

9、用物質(zhì)：二噁烷、苯酚等 以二噁烷為例：SN/T 1784-2006,頂空氣相色譜-質(zhì)譜法： -頂空進(jìn)樣，交聯(lián)5%苯基甲基硅烷毛細(xì)管柱 ，質(zhì)譜檢測器,下限2.5mg/kg,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（2） 在塑化劑檢驗中的應(yīng)用,GB/T 21911-2008,含16中鄰苯二甲酸酯類增塑劑，不包含鄰苯二甲酸二異壬酯DINP和鄰苯二甲酸二異癸酯DIDP.,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（2） 在塑化劑檢驗中的應(yīng)用,DIDP 1ppm,DIDP 10ppm,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用, GB/T 19648-2006 水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法 GB/T 1

10、9426-2003 蜂蜜、果汁和果酒中304種農(nóng)藥多殘留測定方法 氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 GB/T 19650-2005 動物組織中437種農(nóng)藥多殘留測定方法 氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （已作廢）,（3） 在農(nóng)藥殘留檢驗中的應(yīng)用,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,2010年版中國藥典一部附錄收載“農(nóng)藥殘留量測定法” 采用氣相色譜法，ECD，NPD檢測 收載品種：甘草，黃芪，人參總皂苷，人參莖葉總皂苷,（3） 在農(nóng)藥殘留檢驗中的應(yīng)用,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,發(fā)展趨勢：測定方法分兩個層次： 一為色譜法（GC、HPLC） 方法包括樣品前處理（提取、凈化）、色譜測定、 色譜

11、驗證和質(zhì)譜確證 二為色-質(zhì)聯(lián)機法（GC/MS、LC/MS） 方法包括樣品前處理（提取、凈化）、色譜質(zhì)聯(lián)機測定,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，LC/MS,（1） 在藥典中的應(yīng)用,（3） 非法添加及有害殘留檢驗中的應(yīng)用,（2） 主成分及有關(guān)物質(zhì)分析中的應(yīng)用,（4） 基因工程藥品檢驗中的應(yīng)用,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（1） 在藥典中的應(yīng)用, 2010年版 中國藥典一部收錄三個品種,- 川楝子及苦楝皮中的川楝素進(jìn)行含量測定,川楝素(Toosendanin): C30H38O11 MW.574.62,反相C18體系，乙腈-0.01%甲酸溶液（31:69）為流動相，采用單級四級桿質(zhì)譜檢測器，電噴霧離子化（E

12、SI）負(fù)離子模式下選擇質(zhì)荷比（m/z）為573的離子進(jìn)行檢測。理論塔板數(shù)按川楝素計算應(yīng)不低于8000。通過外標(biāo)法，以川楝素兩個峰面積之和計算川楝素的含量。,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（1） 在藥典中的應(yīng)用, 2010年版 中國藥典一部收錄三個品種,- 千里光中的阿多尼弗林堿進(jìn)行了雜質(zhì)檢查,阿多尼弗林堿 Adonifoline C18H23NO7，MW= 365,具有細(xì)胞毒性,反相C18體系，乙腈-0.5%甲酸溶液（7:93）為流動相,采用單級四級桿質(zhì)譜為檢測器，電噴霧離子化（ESI）正離子模式下選擇質(zhì)荷比（m/z）為366離子進(jìn)行檢測。理論塔板數(shù)按阿多尼弗林堿計算應(yīng)不低于8000。以百合堿

13、為內(nèi)標(biāo)，計算校正因子，測定阿多尼弗林堿的含量。,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（1） 在藥典中的應(yīng)用, USP32,血管升壓素（Vasopressin ）: ESI+，1084（單電荷）和 543（雙電荷）； 人重組血清白蛋白（Recombinant Albumin Human）: 585個 氨基酸組成，分子量66,438 Da，ESI+多電荷質(zhì)譜圖去卷積， 20Da之內(nèi)誤差； 醋酸去氨加壓素（Desmopressin Acetate）: ESI+， m/z 1069，MS/MS，m/z 641、 742和 995子離子。,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（2） 主成分及有關(guān)物質(zhì)分析中的應(yīng)用,*

14、 藥典中的定性鑒別（已知物的鑒別）, 化學(xué)、紅外、紫外、色譜保留時間,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（2） 主成分及有關(guān)物質(zhì)分析中的應(yīng)用,鑒定數(shù)據(jù)點系統(tǒng),二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（2） 主成分及有關(guān)物質(zhì)分析中的應(yīng)用,相對強度的容許量,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（2） 主成分及有關(guān)物質(zhì)分析中的應(yīng)用,相對強度的容許量, 20 %, 20 %, 25 %, 30 %, 50 %,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（2） 主成分及有關(guān)物質(zhì)分析中的應(yīng)用,- 鹽酸洛美沙星光降解分析,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,鹽酸洛美沙星光降解分析,A,B,C,A M+H 308.0,B M+H 294.3,C

15、M+H 368.0,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（2） 非法添加及有害殘留檢驗中的應(yīng)用, 2006年3月，SFDA通用補充檢驗方法及項目的批準(zhǔn) - 治療肥胖癥中成藥（SFDA2006004） 麻黃堿、芬氟拉明、西布曲明 - 治療消渴癥中成藥（SFDA2006005） 苯乙雙胍、格列吡嗪、格列本脲 - 消腫止痛類中成藥（SFDA2006006） 雙氯芬酸、氨基比林 - 止咳平喘類中成藥（SFDA2006007） 茶堿 - 鎮(zhèn)靜安神類中成藥（SFDA2006008） 地西泮、氯硝西泮 - 鎮(zhèn)靜安神類中成藥（SFDA2006024） 艾司唑侖 - 補腎壯陽類中成藥（SFDA2006009） 西地那

16、非、他達(dá)拉非,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（3） 非法添加及有害殘留檢驗中的應(yīng)用,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（3） 非法添加及有害殘留檢驗中的應(yīng)用,* 糖皮質(zhì)激素的基本結(jié)構(gòu)中均具有環(huán)戊烷駢多氫菲母核，其中C3的酮基、C20的羰基及C4-5的雙鍵是保持生理功能所必需，結(jié)構(gòu)上可通過在C12引入雙鍵，在C6、 C9、 C16 、C21引入結(jié)構(gòu)修飾基團(tuán)來增強其抗炎作用，減弱水鹽代謝作用。,M1+準(zhǔn)分子離子峰： 潑尼松龍 m/z361.2 潑尼松 m/z359.3 地塞米松 m/z393.2 醋酸可的松 m/z403.2 醋酸潑尼松龍 m/z403.2 醋酸潑尼松 m/z401.3 醋酸地塞米松

17、m/z435.1,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,（3） 非法添加及有害殘留檢驗中的應(yīng)用, 糖皮質(zhì)激素類藥物,HPLC-UV MS色譜圖 （a）七種糖皮質(zhì)激素對照品；（b）供試品,* 以潑尼松計算，柱上靈敏度達(dá)到0.5ng,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,保健食品：肥胖癥、消渴癥、消腫止痛、補腎壯陽,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,磷酸二酯酶5（PDE5）抑制劑類,Sildenafil (Viagra) MS: 474.2,Homosildenafil MS: 488.2,Hydroxy-homosildenafil MS: 504.2,Acetildenafil（Hongdenafil） MS:

18、466.3,Tadalafil MS: 389.1,Vardenafil MS: 488.2,Aildenafil MS: 488.2,Hydroxysildenafil MS: 490.2,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,西地那非 M+1:475.2,Hydroxy-homosildenafil,- 磷酸二酯酶5（PDE5）抑制劑類藥物類似物分析,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用, 問題（1）成鹽藥物檢驗結(jié)論的描述,- 改善藥物理化性質(zhì) - 增強藥物的穩(wěn)定性，溶解性 - 影響藥物的作用時間 - 減輕了毒副作用等功能， 保持藥物療效是成鹽的前提 -氨茶堿，鹽酸克倫特羅，雙氯芬酸鈉、枸櫞酸西地那非等。

19、,-例：檢出雙氯芬酸，以雙氯芬酸鈉計含量為_%,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用, 問題（2） 最小檢出限的確定,2ng,1ng,100ng,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用, 問題（3）未檢出結(jié)論的描述,- 儀器靈敏度的表述 - LOD的重要性 - 殘留與非法添加（底線的選取）,-未檢出檢出西地那非，LOD為以枸櫞酸西地那非計為_ng,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用, 問題（5）定性的瓶頸,* 液質(zhì)聯(lián)用定性鑒別需要對照品,* 無對照品可選用參考品參考品 - 單晶衍射 - NMR+HRMS+EA - 驗證的通用譜庫的高分辨分子離子及特征碎片, 問題（6）定性鑒別與基線分離（R1.5）,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用, 基因工程蛋白藥物中抗生素殘留檢測,氨芐西林MS/MS,Conv.= 0.0525g/mL， 0.5ng（10L）， SN4,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用, 食品中氯霉素的殘留檢測, HPLC & MRM（ODS，MeCN-H2O，Gradient program） ESI(-)， Q1=321,Q3=152, 194 and 257,C11H12Cl2N2O5 FW=323.13,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用, 食品中氯霉素的殘留檢測(樣品),二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用的應(yīng)用,甲氨蝶呤中的長春新堿檢測,“甲氨蝶呤”事件,二、質(zhì)譜法在藥品檢驗用