中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB5009.245—2016

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品中聚葡萄糖的測(cè)定

2016-08-31發(fā)布2016-09-20實(shí)施

中華人民共和國(guó)

國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

發(fā)布

GB5009.245—2016

1

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品中聚葡萄糖的測(cè)定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中聚葡萄糖的測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中添加的聚葡萄糖的測(cè)定。

2術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

2.1

聚葡萄糖[(

C6H10O5)n]

由葡萄糖、山梨糖醇和檸檬酸(或磷酸)按一定比例混合,在高溫下加熱聚合并精制、干燥而成的多

聚體,平均聚合度12。屬于可溶性膳食纖維。

3原理

食品中聚葡萄糖經(jīng)熱水浸提、超濾離心后,濾液經(jīng)酶解去除淀粉、果聚糖等干擾物后,再用離子色

譜-脈沖安培檢測(cè)器定量測(cè)定聚葡萄糖含量。

4試劑和材料

除非另有說(shuō)明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

4.1試劑

4.1.1氫氧化鈉溶液(50%):色譜純,離子色譜專(zhuān)用。

4.1.2冰乙酸(CH3COOH)。

4.1.3三水合乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)。

4.1.4無(wú)水乙酸鈉(CH3COONa)。

4.1.5果聚糖酶(fructanase):≥2000U/mL。

4.1.6淀粉葡糖苷酶(Amyloglucosidase):≥3260U/mL(可溶性淀粉);≥200U/mL(對(duì)硝基酚-

β

-麥

芽糖苷,

p-NP-

βmaltoside)。

4.1.7異淀粉酶(Isoamylase):≥1000U/mL。

4.2試劑配制

4.2.1乙酸溶液(0.2mol

/L):準(zhǔn)確吸取1.

2mL冰乙酸,用水稀釋至100mL。

4.2.2乙酸鈉溶液(0.2mol

/L):準(zhǔn)確稱取2.

72g三水合乙酸鈉,用水溶解并稀釋至100mL

。

4.2.3乙酸鹽緩沖液(

pH

為4.

5):將28mL乙酸溶液(0.2mol

/L)與22mL乙酸鈉溶液(

0.2mol

/L)混

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合,用水稀釋至100mL。

4.2.4混合酶液:分別吸取680μL果聚糖酶、84μL淀粉葡糖苷酶、17μL異淀粉酶混合,加乙酸鹽緩

沖液稀釋至20mL?；旌厦敢号R用現(xiàn)配。

4.3流動(dòng)相

4.3.1流動(dòng)相A(含0.15mol

/L氫氧化鈉):準(zhǔn)確吸取15.

7mL氫氧化鈉溶液(50%),用預(yù)先脫氣的水

稀釋2L,惰性氣體保護(hù)。

4.3.2流動(dòng)相B(含0.15mol

/L氫氧化鈉,

0.50mol

/L乙酸鈉):準(zhǔn)確稱量41g無(wú)水乙酸鈉(或68g三

水合乙酸鈉),用流動(dòng)相A溶解定容至1L,混勻,過(guò)0.

45μm膜,脫氣。

注:配制流動(dòng)相時(shí),去離子水需預(yù)先脫氣0.

5h,定容后的流動(dòng)相混勻時(shí)倒置混勻5~6次,不可劇烈振搖。配好的

流動(dòng)相沿儲(chǔ)液瓶壁緩緩倒入,脫氣0.

5h后惰性氣體保護(hù)。

4.4參考物質(zhì)

聚葡萄糖[(

C6H10O5)n]:純度大于90%,CAS:68424-04-4。

注:為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,如能確定添加的聚葡萄糖來(lái)源,應(yīng)選用食品中添加的聚葡聚糖同源的參考物質(zhì),并達(dá)到

FCC級(jí)。

4.5參考物質(zhì)溶液的配制

4.5.1參考物質(zhì)儲(chǔ)備液(2.00mg/g):準(zhǔn)確稱取0.20g聚葡萄糖參考物質(zhì)(精確至0.0001g)至已預(yù)先

稱重的100mL具螺口塞的試樣瓶中(精確至0.

001g)。加入約100g預(yù)熱至80℃的去離子水,擰緊螺

口塞,渦旋振蕩30s,將試樣瓶置于80℃水浴10min,每隔5min振蕩一次,以使聚葡萄糖充分溶解,取

出試樣瓶,冷卻至室溫,稱重(精確至0.

001g)。參考物質(zhì)儲(chǔ)備液于4℃保存,有效期1個(gè)月。

4.5.2參考物質(zhì)中間液:分別精確稱量10.0g、7.50g、5.00g、3.75g、2.50g、1.50g參考物質(zhì)儲(chǔ)備液(精

確至0.

0001g)加水至20.

0g(精確至0.

0001g),得到濃度為1.

000mg

/g、

0.750mg/g、0.500mg/g、

0.375mg/g、0.250mg/g、0.150mg/g的參考物質(zhì)中間液。

4.5.3參考物質(zhì)工作液:取2mL離心管,稱量(精確至0.0001g),精確稱量參考物質(zhì)中間液0.20g(精

確至0.

0001g)轉(zhuǎn)移至已稱重的離心管中,加入酶混合液0.

8mL,稱量(精確至0.0001g),振蕩混合均

勻,于50℃水浴60min,沸水浴10min,取出,冰浴5min,于10000r/min離心10min。上清液過(guò)

0.22μm濾膜,進(jìn)樣分析,得到濃度分別為200μg/g、150μg/g、100μg/g、75.0μg/g、50.0μg/g、

30.0μg/g的參考物質(zhì)工作液系列,進(jìn)樣分析。以此6點(diǎn)參考物質(zhì)工作液上機(jī)獲得工作曲線,其回歸方

程的決定系數(shù)(

R2值)應(yīng)不小于0.995。

5儀器與設(shè)備

5.1分析天平:感量分別為1mg,0.1mg。

5.2恒溫水浴箱:控溫精度±1℃。

5.3高速離心機(jī):轉(zhuǎn)速≥10000r/min。

5.4渦旋振蕩器。

5.5微量可調(diào)移液器:20μL~200μL、200μL~1000μL。

5.6針筒式過(guò)濾器:孔徑0.22μm。

5.7超濾離心設(shè)備:100000Da分子截留,聚醚砜膜,0.5mL容積。

5.8磁力攪拌器:帶攪拌子。

5.9離子色譜儀:配備脈沖安培檢測(cè)器、梯度泵。

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6操作步驟

6.1試樣處理

6.1.1固體試樣:研磨、粉碎,分析前密閉保存,避免水分變化。

6.1.2液體試樣:測(cè)定前需混合搖勻。

6.2聚葡萄糖提取

6.2.1固體試樣:取100mL具塞試樣瓶,加入1粒磁力攪拌子,蓋上螺口塞,稱量(精確至0.001g),記

為m1。準(zhǔn)確稱取一定量試樣(約含聚葡萄糖0.

05g,精確至0.

0001g,記為m2)至試樣瓶中,加100mL

預(yù)熱至80℃的水,磁力攪拌30s,80℃水浴10min,每5min磁力攪拌30s。取出試樣瓶冷卻至室溫

后稱量(精確至0.

001g),記為m3。

6.2.2液體試樣(飲料、液態(tài)奶等):取100mL具塞試樣瓶,稱量(精確至0.001g),記為m1。準(zhǔn)確吸取

一定量試樣(約含聚葡萄糖0.

05g,精確至0.

0001g,記為m2)至試樣瓶中,加100mL水,振蕩混合均

勻,稱量(精確至0.

001g),記為m3。

6.2.3適量吸取樣液至2.0mL的離心管中,10000r/min離心15min,取上清液過(guò)0.22μm濾膜,取

0.45mL濾液加入1.5mL帶有分子截留膜的離心管中,于10000r/min超濾離心30min。注意觀察

是否離心完全及離心液的澄清度,如截留膜上方留有樣液或離心液混濁,可加大轉(zhuǎn)速、延長(zhǎng)離心時(shí)間,或

增加稀釋倍數(shù)(

F)。

6.3酶解

6.3.1取2mL離心管,稱量(精確至0.0001g),記為m4。

6.3.2吸取0.2mL超濾離心液加入離心管中,稱量(精確至0.0001g),記為m5;加入酶混合液

0.8mL,稱量(精確至0.0001g),記為m6;振蕩混合均勻,于50℃水浴60min,沸水浴10min,取出,

冰浴5min,于10000r/min離心10min。上清液過(guò)0.

2μm濾膜,進(jìn)樣分析。上清液需在72h內(nèi)檢測(cè)。

6.4色譜參考條件

檢測(cè)條件見(jiàn)附錄B。

6.5分析結(jié)果的表述

試樣中聚葡萄糖含量按式(

1)計(jì)算:

X=ρ×F×c×m

6-m4

m5-m4

×m

3-m1

m2

×100

10

6

…………(1)

式中:

X———試樣中聚葡萄糖的含量,單位為克每百克(g/100g);

ρ

———由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的聚葡萄糖的濃度,單位為微克每克(

μg

/g);

F

———稀釋倍數(shù);

c

———聚葡萄糖參考物質(zhì)的純度,%;

m6

———離心管、酶解樣液、混合酶液的總質(zhì)量,單位為克(

g);

m4

———空離心管質(zhì)量,單位為克(

g);

m5

———離心管、用于酶解樣液總質(zhì)量,單位為克(

g);

m3

———加水后試樣瓶總質(zhì)量,單位為克(

g);

m1

———試樣瓶總質(zhì)量,單位為克(

g);

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m2

———試樣質(zhì)量,單位為克(

g);

100———將結(jié)果表示為百分含量的系數(shù);

10

6

———微克(

μg)與克(g)的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

7精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

8其他

最小稱樣量為5g時(shí),固體試樣檢出限為0.

2mg

/100g,定量限為0.

5mg

/100g;液體試樣為檢出

限為0.

15mg

/100g,定量限為0.

5mg

/100g。

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附錄A

酶活性測(cè)定

A.1果聚糖酶酶活力測(cè)定方法

A.1.1原理

在pH4.

5,溫度40℃,底物(蔗果三糖)濃度為10mmol

/L的標(biāo)準(zhǔn)條件下,

1min釋放1μmol果糖

所需的酶量為1U。

A.1.2試劑和溶劑

A.1.2.1乙酸(0.2mol

/L):準(zhǔn)確吸取12mL冰乙酸,用水稀釋至1000mL。

A.1.2.2乙酸鈉溶液(0.2mol

/L):準(zhǔn)確稱取27.

2g三水合乙酸鈉,用水溶解并稀釋至1000mL

。

A.1.2.3乙酸鹽緩沖液(

pH

為4.

5):將280mL乙酸溶液(0.2mol

/L)與220mL乙酸鈉溶液(

0.2mol

/L)

混合,用水稀釋至1000mL。

A.1.2.4氫氧化鈉溶液(2mol

/L):準(zhǔn)確稱取80g氫氧化鈉,用水溶解并稀釋至1000mL。

A.1.2.53,5-二硝基水楊酸試劑(DNS):將6.3g3,5-二硝基水楊酸試劑和262mL2mol

/LNaOH溶

液,加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,再加

5g

苯酚和

5g

亞硫酸鈉,攪拌溶解,冷卻后

加蒸餾水定容至1000mL,貯于棕色瓶中備用。

A.1.2.6果糖標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL):準(zhǔn)確稱取80℃烘至恒重的分析純果糖100mg,置于小燒杯中,加少

量乙酸鹽緩沖液溶解后,轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中,用乙酸鹽緩沖液定容至100mL,混勻,

4℃冰箱中保

存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.2.7蔗果三糖溶液(10mmol

/L):精確稱取5.

04g蔗果三糖,用乙酸鹽緩沖液溶解并稀釋至

1000mL。

A.1.3儀器

A.1.3.1分析天平。

A.1.3.2電熱恒溫水浴鍋。

A.1.3.3可見(jiàn)光分光光度計(jì)。

A.1.3.4計(jì)時(shí)器。

A.1.4分析步驟

A.1.4.1果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取乙酸鹽緩沖液4.

0mL至25mL刻度試管中,加入DNS試劑5.0mL,沸水浴加入5min,冷卻

至室溫,用水定容至25mL,制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣。

分別吸取果糖標(biāo)準(zhǔn)液1.

00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL于100mL

容量瓶中,用乙酸鹽緩沖液定容至100mL,配制成濃度0.

10mg

/mL、

0.20mg/mL、0.30mg/mL、

0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL、0.70mg/mL果糖標(biāo)準(zhǔn)使用液,吸取果糖標(biāo)準(zhǔn)使用液各

2.0mL,分別加入到25mL刻度試管中,再分別加入2.0mL乙酸鹽緩沖液和5.0mLDNS試劑。將各

管搖勻,在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min,取出,冷卻至室溫,加水定容至25mL,加塞后顛倒混勻,放置

30min,以標(biāo)準(zhǔn)空白液為對(duì)照調(diào)零,在540nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo),果糖含量(

mg

)

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為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

A.1.4.2待測(cè)酶溶液的配制

稱取測(cè)試酶樣品,用乙酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋、定容(稀釋后的酶液中果聚糖酶活力在0.

04U/mL~

0.08U/mL之間)。

A.1.4.3測(cè)定步驟

吸取10.

0mL蔗果三糖溶液,40℃平衡20min。

吸取10.

0mL待測(cè)酶液,40℃平衡20min。

吸取2.

00mL平衡后待測(cè)酶液,加入到25mL刻度試管中,再加入5.0mLDNS試劑,混勻,然后

加入2.

0mL平衡后的蔗果三糖溶液,40℃平衡30min,沸水浴加熱5min,冷卻至室溫,加水定容至

25mL,加塞后顛倒混勻,放置30min,以標(biāo)準(zhǔn)空白液為對(duì)照調(diào)零,在540nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)B。

吸取2.

0mL平衡后的待測(cè)酶液,加入到25mL刻度試管中,加入2.0mL平衡后的蔗果三糖溶液,

混勻40℃平衡30min,然后再加入5.

0mLDNS試劑,混勻以終止反應(yīng),沸水浴加熱5min,冷卻至室

溫,用水定容至25mL,加塞后顛倒混勻,放置30min,以標(biāo)準(zhǔn)空白液為對(duì)照調(diào)零,在540nm處測(cè)定吸

光度值A(chǔ)E。

A.1.5酶活力計(jì)算

果聚糖酶的酶活力按式(A.

1)計(jì)算:

XD=

[(

AE-AB)×K+C0]

M×t

×1000…………(A.

1)

式中:

XD———待測(cè)酶液的果聚糖酶活力,單位為活力單位每毫升(U/mL);

AE

———酶反應(yīng)液的吸光度;

AB

———酶空白液的吸光度;

K

———標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;

C0

———標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;

M

———果糖的摩爾質(zhì)量,M(

C6H12O6)=180.2g/mol;

t

———酶解反應(yīng)的時(shí)間,單位為分(min);

1000———換算系數(shù)。

A.2異淀粉酶酶活力測(cè)定方法

A.2.1原理

在pH4.

0,溫度40℃,底物(牡蠣糖,oysterglycogen)濃度為10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)條件下,1min釋

放出1μmol還原糖當(dāng)量(以葡萄糖計(jì))所需要的酶量為1U。

A.2.2試劑和溶劑

A.2.2.1乙酸鹽緩沖液(

pH

為4.

0):稱取54.4g三水和乙酸鈉(CH3COONa·3H2O),溶于水,加

92mL乙酸(冰醋酸),稀釋至1000mL。

A.2.2.2氫氧化鈉溶液(2mol

/L):準(zhǔn)確稱取80g氫氧化鈉,用水溶解并稀釋至1000mL。

A.2.2.33,5-二硝基水楊酸試劑(DNS):將6.3g3,5-二硝基水楊酸試劑和262mL氫氧化鈉溶液,加

到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,再加5g苯酚和5g亞硫酸鈉,攪拌溶解,冷卻后加蒸

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餾水定容至1000mL,貯于棕色瓶中備用。

A.2.2.4葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL):稱取無(wú)水葡萄糖100mg,加乙酸鹽緩沖液溶解,定容至100mL。

A.2.2.5牡蠣糖溶液(10mg/mL):精確稱取1.0g牡蠣糖,用乙酸鹽緩沖液溶解并稀釋至100mL。

A.2.3儀器

A.2.3.1分析天平。

A.2.3.2電熱恒溫水浴鍋。

A.2.3.3分光光度計(jì)。

A.2.3.4計(jì)時(shí)器。

A.2.4分析步驟

A.2.4.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取乙酸鹽緩沖液4.

0mL至25mL刻度試管中,加入DNS試劑5.0mL,沸水浴加入5min,冷卻

至室溫,用水定容至25mL,制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣。

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1.

00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL于

100mL容量瓶中,用乙酸鹽緩沖液定容至100mL,配制成濃度0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、

0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL、0.70mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液,吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液各

2.0mL,分別加入到25mL刻度試管中,再分別加入2.0mL乙酸鹽緩沖液和5.0mLDNS試劑。將各

管搖勻,在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min,取出,冷卻至室溫,加水定容至25mL,加塞后顛倒混勻,放置

30min,以標(biāo)準(zhǔn)空白液為對(duì)照調(diào)零,在540nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo),葡萄糖含量

(

mg

)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

A.2.4.2待測(cè)酶溶液的配制

稱取測(cè)試酶樣品,用乙酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋、定容(稀釋后的酶液中果聚糖酶活力在0.

04U/mL~

0.08U/mL之間)。

A.2.4.3測(cè)定步驟

吸取10.

0mL牡蠣糖溶液,40℃平衡20min。

吸取10.

0mL待測(cè)酶液,40℃平衡20min。

吸取2.

0mL平衡后待測(cè)酶液,加入到25mL刻度試管中,再加入5.0mLDNS試劑,混勻,然后加

入2.

0mL平衡后的牡蠣糖溶液,40℃平衡30min,沸水浴加熱5min,冷卻至室溫,加水定容至25mL,

加塞后顛倒混勻,放置30min,以標(biāo)準(zhǔn)空白液為對(duì)照調(diào)零,在540nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)B。

吸取2.

0mL平衡后的待測(cè)酶液,加入到25mL刻度試管中,加入2.0mL平衡后的牡蠣糖溶液,混

勻40℃平衡30min,然后再加入5.

0mLDNS試劑,混勻以終止反應(yīng),沸水浴加熱5min,冷卻至室溫,

加水定容至25mL,加塞后顛倒混勻,放置30min,以標(biāo)準(zhǔn)空白液為對(duì)照調(diào)零,在540nm處測(cè)定吸光度

值A(chǔ)E。

A.2.5酶活力計(jì)算

異淀粉酶的酶活力按式(A.

2)計(jì)算:

XD=

[(

AE-AB)×K+C0]

M×t

×1000…………(A.

2)

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8

式中:

XD———待測(cè)酶液的異淀粉酶活力,單位為活力單位每毫升(U/mL);

AE

———酶反應(yīng)液的吸光度;

AB

———酶空白液的吸光度;

K

———標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;

C0

———標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;

M

———葡萄糖的摩爾質(zhì)量,M(

C6H12O6)=180.2g/mol;

t

———酶解反應(yīng)的時(shí)間,單位為分(min);

1000———換算系數(shù)。

A.3淀粉葡糖苷酶酶活力測(cè)定方法

A.3.1以可溶性淀粉為底物的酶活力

以可溶性淀粉為底物的酶活力測(cè)定參照GB8275—2009《

α-淀粉酶制劑》中酶活力的測(cè)定方法。

A.3.2以對(duì)硝基酚-β-麥芽糖苷為底物的酶活力

A.3.2.1原理

在pH4.

5,溫度為40℃,底物(對(duì)硝基酚-

β-麥芽糖苷)濃度為10mmol

/L,有過(guò)量β-葡糖苷酶存在

的標(biāo)準(zhǔn)條件下,每分鐘從對(duì)硝基酚-

β-麥芽糖苷釋放出1μmol對(duì)硝基酚(p-NP)所需要的酶量為1U。

A.3.2.2試劑和溶劑

A.3.2.2.1乙酸(0.2mol

/L):準(zhǔn)確吸取12mL冰乙酸,用水稀釋至1000mL。

A.3.2.2.2乙酸鈉溶液(0.2mol

/L):準(zhǔn)確稱取27.

2g三水合乙酸鈉,用水溶解并稀釋至1000mL

。

A.3.2.2.3乙酸鹽緩沖液(

pH

為4.

5):將280mL乙酸溶液(0.2mol

/L)與220mL乙酸鈉溶液

(

0.2mol

/L)混合,用水稀釋至1000mL。

A.3.2.2.4碳酸鈉溶液(1mol

/L):準(zhǔn)確稱取105.

9g碳酸鈉,用水溶解并稀釋至1000mL

。

A.3.2.2.5對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL):稱取對(duì)硝基酚100mg,加乙酸鹽緩沖液溶解,定容至100mL。

A.3.2.2.6β-葡糖苷酶溶液:用乙酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋、定容(稀釋后的酶液中β-葡糖苷酶活力在

2U/mL~4U/mL之間)。

A.3.2.2.7對(duì)硝基酚-

β-麥芽糖苷溶液(

10mmol

/mL):準(zhǔn)確稱取4.

63g對(duì)硝基酚-β

-麥芽糖苷,用β-葡

糖苷酶溶液溶解并稀釋至1000mL。

A.3.2.3儀器

A.3.2.3.1分析天平。

A.3.2.3.2電熱恒溫水浴鍋。

A.3.2.3.3分光光度計(jì)。

A.3.2.3.4計(jì)時(shí)器。

A.3.2.4分析步驟

A.3.2.4.1對(duì)硝基苯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取乙酸鹽緩沖液2.

0mL,加入1.0mL碳酸鈉溶液,混勻,制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣。

分別吸取對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)液1.

00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL,分別

GB5009.245—2016

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用乙酸鹽緩沖液定容至100mL,配制成濃度0.

10mg

/mL、

0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、

0.50mg/mL、0.60mg/mL、0.70mg/mL對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)使用液,吸取對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)使用液各1mL,分

別加入到5mL刻度試管中,再分別加入1.

0mL乙酸鹽緩沖液和1.0mL碳酸鈉溶液,以標(biāo)準(zhǔn)空白液為

對(duì)照調(diào)零,在400nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo),對(duì)硝基酚含量(

mg)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)

曲線。

A.3.2.4.2待測(cè)酶溶液的配制

稱取測(cè)試酶樣品,用乙酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋、定容(稀釋后的酶液中β-葡糖苷酶活力在2U/mL~

4U/mL之間)。

A.3.2.4.3測(cè)定步驟

吸取10.

0mL對(duì)硝基酚-

β-麥芽糖苷溶液,

40℃平衡20min。

吸取10.

0mL待測(cè)酶液,40℃平衡20min。

吸取1.

0mL平衡后待測(cè)酶液,加入到5mL刻度試管中,再加入1.0mL碳酸鈉溶液,混勻,然后加

入1.

0mL平衡后的對(duì)硝基酚-

β-麥芽糖苷溶液,

40℃平衡10min,室溫放置5min,以標(biāo)準(zhǔn)空白液為對(duì)

照調(diào)零,在400nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)B。

吸取1.

0mL平衡后待測(cè)酶液,加入到5mL刻度試管中,再加入1.0mL平衡后的對(duì)硝基酚-

β-麥芽

糖苷溶液,混勻,40℃平衡10min,然后加入1.

0mL碳酸鈉溶液,室溫放置5min,以標(biāo)準(zhǔn)空白液為對(duì)

照調(diào)零,在400nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)E。

A.3.2.5酶活力計(jì)算

葡糖苷酶的酶活力按式(A.

3)計(jì)算:

XD=

[(

AE-AB)×K+C0]

M×t

×1000…………(A.

3)

式中:

XD———待測(cè)酶液的淀粉葡糖苷酶活力,單位為活力單位每毫升(U/mL);

AE

———酶反應(yīng)液的吸光度;

AB

———酶空白液的吸光度;

K

———標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;

C0

———標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;

M

———對(duì)硝基酚的摩爾質(zhì)量,M(

C6H5NO3)=136.11g/mol;

t

———酶解反應(yīng)的時(shí)間,單位為分(min);

1000———換算系數(shù)。

GB5009.245—2016

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附錄B

色譜參考條件

B.1四電位離子色譜檢測(cè)條件

B.1.1離子色譜條件

分析柱:

CarboPaPA1(粒徑10μm,250mm×2mm);保護(hù)柱:CarboPaPA1(粒徑10μm,50mm×

2mm),或等效柱。

進(jìn)樣量:

20μL;

柱溫:

30℃。

注:給出分析柱信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)