中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB4789.30—2016

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)

2016-12-23發(fā)布2017-06-23實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局

發(fā)布

GB4789.30—2016

Ⅰ

前言

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB4789.30—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏

菌檢驗(yàn)》。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB4789.

30—2010相比,主要變化如下:

———增加了“第二法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法”;

———增加了“第三法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法”;

———修改了范圍。

GB4789.30—2016

1

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(

Listeriamonocytogenes)的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的定性檢驗(yàn);第二法適用于單核細(xì)胞增生李

斯特氏菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù);第三法適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

含量較低(<100CFU/

g)而雜菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù),特別是牛奶、水以

及含干擾菌落計(jì)數(shù)的顆粒物質(zhì)的食品。

2設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:

2.1冰箱:2℃~5℃。

2.2恒溫培養(yǎng)箱:30℃±1℃、36℃±1℃。

2.3均質(zhì)器。

2.4顯微鏡:10x~100x。

2.5電子天平:感量0.1g。

2.6錐形瓶:100mL、500mL。

2.7無(wú)菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

2.8無(wú)菌平皿:直徑90mm。

2.9無(wú)菌試管:16mm×160mm。

2.10離心管:30mm×100mm。

2.11無(wú)菌注射器:1mL。

2.12單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效

標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.13英諾克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.14伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.15斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.16金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他產(chǎn)β-溶血環(huán)金葡菌,或其他等效標(biāo)

準(zhǔn)菌株。

2.17馬紅球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.18小白鼠:ICR體重18g~22g。

2.19全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

3培養(yǎng)基和試劑

3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE):見(jiàn)A.1。

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2

3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE):見(jiàn)A.2。

3.3李氏增菌肉湯LB(LB1,LB2):見(jiàn)A.3。

3.41%鹽酸吖啶黃(acriflavineHCl)溶液:見(jiàn)A.3.2.1、A.3.2.2。

3.51%萘啶酮酸鈉鹽(naladixicacid)溶液:見(jiàn)A.3.2.1、A.3.2.2。

3.6PALCAM瓊脂:見(jiàn)A.4。

3.7革蘭氏染液:見(jiàn)A.5。

3.8SIM動(dòng)力培養(yǎng)基:見(jiàn)A.6。

3.9緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和V-P試驗(yàn)用]:見(jiàn)A.7。

3.105%~8%羊血瓊脂:見(jiàn)A.8。

3.11糖發(fā)酵管:見(jiàn)A.9。

3.12過(guò)氧化氫試劑:見(jiàn)A.10。

3.13李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基。

3.14生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)。

3.15緩沖蛋白胨水:見(jiàn)A.11。

第一法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)

4檢驗(yàn)程序

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。

圖1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序

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5操作步驟

5.1增菌

以無(wú)菌操作取樣品25g(mL)加入到含有225mLLB

1增菌液的均質(zhì)袋中,在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)

均質(zhì)1min~2min;或放入盛有225mLLB

1增菌液的均質(zhì)杯中,以8000r

/min~10000r/min均質(zhì)

1min~2min。于30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,移取0.1mL,轉(zhuǎn)種于10mLLB2增菌液內(nèi),于30℃±

1℃培養(yǎng)24h±2h。

5.2分離

取LB

2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板,于36℃±1℃培養(yǎng)

24h~48h,觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落,

周?chē)凶睾谏馊?有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征,參照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行

判定。

5.3初篩

自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個(gè)~5個(gè)典型或可疑菌落,分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管,于

36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,同時(shí)在TSA-YE平板上劃線,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,然后選擇木

糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。

5.4鑒定(或選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)等)

5.4.1染色鏡檢:李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌,大小為(0.4μm~0.5μm)×(0.5μm~2.0μm);用

生理鹽水制成菌懸液,在油鏡或相差顯微鏡下觀察,該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng)。

5.4.2動(dòng)力試驗(yàn):挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺半固體或SIM動(dòng)力培養(yǎng)基,于25℃~30℃培養(yǎng)

48h,李斯特氏菌有動(dòng)力,在半固體或SIM培養(yǎng)基上方呈傘狀生長(zhǎng),如傘狀生長(zhǎng)不明顯,可繼續(xù)培養(yǎng)

5d,再觀察結(jié)果。

5.4.3生化鑒定:挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落,進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn),過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)的菌落繼續(xù)

進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和MR-VP試驗(yàn)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見(jiàn)表1。

5.4.4溶血試驗(yàn):將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為20個(gè)~25個(gè)小格,挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落刺

種到血平板上,每格刺種一個(gè)菌落,并刺種陽(yáng)性對(duì)照菌(單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特

氏菌)和陰性對(duì)照菌(英諾克李斯特氏菌),穿刺時(shí)盡量接近底部,但不要觸到底面,同時(shí)避免瓊脂破裂,

36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,于明亮處觀察,單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯

特氏菌在刺種點(diǎn)周?chē)a(chǎn)生弱的透明溶血圈,英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血圈,伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪

廓清晰的β-溶血區(qū)域,若結(jié)果不明顯,可置4℃冰箱24h~48h再觀察。

注:也可用劃線接種法。

5.4.5協(xié)同溶血試驗(yàn)cAMP(可選項(xiàng)目):在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球

菌,挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間,垂直線兩端不要觸及平行線,距離1mm~

2mm,同時(shí)接種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,于

36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約2mm的β-溶

血增強(qiáng)區(qū)域,斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強(qiáng)區(qū)域,伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現(xiàn)約

5mm~10mm的“箭頭狀”

β-溶血增強(qiáng)區(qū)域,英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。若結(jié)果不明顯,可置

4℃冰箱24h~48h再觀察。

注:5%~8%的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在馬紅球菌一端有溶血增強(qiáng)現(xiàn)象。

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表1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區(qū)別

菌種溶血反應(yīng)葡萄糖麥芽糖

MR-VP

甘露醇鼠李糖木糖七葉苷

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

(

L.monocytogenes)

++++/+-+-+

格氏李斯特氏菌

(

L.grayi)

-+++/++--+

斯氏李斯特氏菌

(

L.seeligeri)

++++/+--++

威氏李斯特氏菌

(

L.welshimeri)

-+++/+-V++

伊氏李斯特氏菌

(

L.ivanovii)

++++/+--++

英諾克李斯特氏菌

(

L.innocua)

-+++/+-V-+

注:+陽(yáng)性;-陰性;V反應(yīng)不定。

5.5小鼠毒力試驗(yàn)(可選項(xiàng)目)

將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于TSB-YE中,于36℃±1℃培養(yǎng)24h,

4000r/min離心5min,

棄上清液,用無(wú)菌生理鹽水制備成濃度為10

10CFU

/mL的菌懸液,取此菌懸液對(duì)3只~5只小鼠進(jìn)行

腹腔注射,每只0.

5mL,同時(shí)觀察小鼠死亡情況。接種致病株的小鼠于2d~5d內(nèi)死亡。試驗(yàn)設(shè)單增

李斯特氏菌致病株和滅菌生理鹽水對(duì)照組。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌對(duì)小鼠有致

病性。

5.6結(jié)果與報(bào)告

綜合以上生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)的結(jié)果,報(bào)告25g(mL)樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特

氏菌。

第二法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法

6檢驗(yàn)程序

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序見(jiàn)圖2。

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圖2單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序

7操作步驟

7.1樣品的稀釋

7.1.1以無(wú)菌操作稱(chēng)取樣品25g(mL),放入盛有225mL緩沖蛋白胨水或無(wú)添加劑的LB肉湯的無(wú)菌

均質(zhì)袋內(nèi)(或均質(zhì)杯)內(nèi),在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min~2min或以8000r/min~10000r/min均

質(zhì)1min~2min。液體樣品,振蕩混勻,制成1∶10的樣品勻液。

7.1.2用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于盛有9mL緩沖蛋

白胨水或無(wú)添加劑的LB肉湯的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換

用1支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。

7.1.3按7.1.2操作程序,制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無(wú)菌吸管或

吸頭。

7.2樣品的接種

根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),選擇2個(gè)~3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),

每個(gè)稀釋度的樣品勻液分別吸取1mL以0.

3mL、0.3mL、0.4mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌

顯色平板,用無(wú)菌L棒涂布整個(gè)平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如瓊脂平板表面有水珠,可放

在25℃~50℃的培養(yǎng)箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。

7.3培養(yǎng)

7.3.1在通常情況下,涂布后,將平板靜置10min,如樣液不易吸收,可將平板放在培養(yǎng)箱36℃±1℃

培養(yǎng)1h;等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿,倒置于培養(yǎng)箱,

36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h。

7.4典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)

7.4.1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征以產(chǎn)品說(shuō)明為準(zhǔn)。

7.4.2選擇有典型單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在

15CFU~150CFU之間的平板,計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。如果:

a)只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在15CFU~150CFU之間且有典型菌落,計(jì)數(shù)該稀釋度平板

上的典型菌落;

b)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于15CFU且有典型菌落,應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型

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菌落;

c)某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于150CFU且有典型菌落,但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落,

應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落;

d)所有稀釋度的平板菌落數(shù)大于150CFU且有典型菌落,應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型

菌落;

e)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在15CFU~150CFU之間且有典型菌落,其中一部分小于

15CFU或大于150CFU時(shí),應(yīng)計(jì)數(shù)最接近15CFU或150CFU的稀釋度平板上的典型菌落。

以上按式(

1)計(jì)算。

f)2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在15CFU~150CFU之間,按式(2)計(jì)算。

7.4.3從典型菌落中任選5個(gè)菌落(小于5個(gè)全選),分別按5.3、5.4進(jìn)行鑒定。

8結(jié)果計(jì)數(shù)

T=AB

Cd

…………(1)

式中:

T———樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù);

A———某一稀釋度典型菌落的總數(shù);

B———某一稀釋度確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);

C———某一稀釋度用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù);

d———稀釋因子。

T=A

1B1/C1+A2B2/C2

1.1d

…………(2)

式中:

T———樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù);

A1

———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);

B1

———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);

C1

———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù);

A2

———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);

B2

———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù);

C2

———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù);

1.1———計(jì)算系數(shù);

d

———稀釋因子(第一稀釋度)。

9結(jié)果報(bào)告

報(bào)告每g(mL)樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌數(shù),以CFU/g(mL)表示;如T值為0,則以小于

1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。

第三法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法

10檢驗(yàn)程序

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖3。

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圖3單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)程序

11操作步驟

11.1樣品的稀釋

按7.

1進(jìn)行。

11.2接種和培養(yǎng)

11.2.1根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),選取3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),接

種于10mLLB

1肉湯,每一稀釋度接種3管,每管接種1mL(如果接種量需要超過(guò)1mL,則用雙料LB1

增菌液)于30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。每管各移取0.

1mL,轉(zhuǎn)種于10mLLB2增菌液內(nèi),于30℃±

1℃培養(yǎng)24h±2h。

11.2.2用接種環(huán)從各管中移取1環(huán),接種李斯特氏菌顯色平板,36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h。

11.3確證試驗(yàn)

自每塊平板上挑取5個(gè)典型菌落(5個(gè)以下全選),按照5.

3、5.4進(jìn)行鑒定。

12結(jié)果與報(bào)告

根據(jù)證實(shí)為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽(yáng)性的試管管數(shù),查MPN檢索表(見(jiàn)附錄B),報(bào)告每g(mL)

樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的最可能數(shù),以MPN/g(mL)表示。

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附錄A

培養(yǎng)基和試劑

A.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)

A.1.1成分

胰胨

17.0g

多價(jià)胨

3.0g

酵母膏

6.0g

氯化鈉

5.0g

磷酸氫二鉀

2.5g

葡萄糖

2.5g

蒸餾水

1000mL

A.1.2制法

將上述各成分加熱攪拌溶解,調(diào)節(jié)

pH

至7.

2±0.2,分裝,121℃高壓滅菌15min,備用。

A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)

A.2.1成分

胰胨

17.0g

多價(jià)胨

3.0g

酵母膏

6.0g

氯化鈉

5.0g

磷酸氫二鉀

2.5g

葡萄糖

2.5g

瓊脂

15.0g

蒸餾水

1000mL

A.2.2制法

將上述各成分加熱攪拌溶解,調(diào)節(jié)

pH

至7.

2±0.2,分裝,121℃高壓滅菌15min,備用。

A.3李氏增菌肉湯(LB1,LB2)

A.3.1成分

胰胨

5.0g

多價(jià)胨

5.0g

酵母膏

5.0g

氯化鈉

20.0g

磷酸二氫鉀

1.4g

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磷酸氫二鈉

12.0g

七葉苷

1.0g

蒸餾水

1000mL

A.3.2制法

將上述成分加熱溶解,調(diào)節(jié)

pH

至7.

2±0.2,分裝,121℃高壓滅菌15min,備用。

A.3.2.1李氏Ⅰ液(LB1)225mL中加入:

1%萘啶酮酸(用0.05mol

/L氫氧化鈉溶液配制)0.

5mL

1%吖啶黃(用無(wú)菌蒸餾水配制)0.3mL

A.3.2.2李氏Ⅱ液(LB2)200mL中加入:

1%萘啶酮酸0.4mL

1%吖啶黃0.5mL

A.4PALCAM瓊脂

A.4.1成分

酵母膏

8.0g

葡萄糖

0.5g

七葉甙

0.8g

檸檬酸鐵銨

0.5g

甘露醇

10.0g

酚紅

0.1g

氯化鋰

15.0g

酪蛋白胰酶消化物

10.0g

心胰酶消化物

3.0g

玉米淀粉

1.0g

肉胃酶消化物

5.0g

氯化鈉

5.0g

瓊脂

15.0g

蒸餾水

1000mL

A.4.2制法

將上述成分加熱溶解,調(diào)節(jié)

pH

至7.

2±0.2,分裝,121℃高壓滅菌15min,備用。

A.4.2.1PALCAM選擇性添加劑

多粘菌素B

5.0mg

鹽酸吖啶黃

2.5mg

頭孢他啶

10.0mg

無(wú)菌蒸餾水

500mL

A.4.2.2制法

將PALCAM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶化后冷卻到50℃,加入2mLPALCAM選擇性添加劑,混勻后傾倒在

無(wú)菌的平皿中,備用。

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A.5革蘭氏染色液

A.5.1結(jié)晶紫染色液

A.5.1.1成分

結(jié)晶紫

1.0g

95%乙醇20.0mL

1%草酸銨水溶液80.0mL

A.5.1.2制法

將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。

A.5.2革蘭氏碘液

A.5.2.1成分

碘

1.0g

碘化鉀

2.0g

蒸餾水

300mL

A.5.2.2制法

將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合,加入蒸餾水少許,充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至300mL。

A.5.3沙黃復(fù)染液

A.5.3.1成分

沙黃

0.25g

95%乙醇10.0mL

蒸餾水

90.0mL

A.5.3.2制法

將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。

A.5.4染色法

A.5.4.1涂片用火焰固定后滴加結(jié)晶紫染液,作用1min,水洗。

A.5.4.2滴加革蘭氏碘液,作用1min,水洗。

A.5.4.3滴加95%乙醇脫色,約15s~30s,直至染色液被洗掉,不要過(guò)分脫色,水洗。

A.5.4.4滴加復(fù)染液,復(fù)染1min,水洗、待干、鏡檢。

A.6SIM動(dòng)力培養(yǎng)基

A.6.1成分

胰胨

20.0g

多價(jià)胨

6.0g

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硫酸鐵銨

0.2g

硫代硫酸鈉

0.2g

瓊脂

3.5g

蒸餾水

1000mL

A.6.2制法

將上述各成分加熱混勻,調(diào)節(jié)

pH

至7.

2±0.2,分裝小試管,121℃高壓滅菌15min,備用。

A.6.3試驗(yàn)方法

挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺接種到SIM培養(yǎng)基中,于25℃~30℃培養(yǎng)48h,觀察結(jié)果。

A.7緩沖葡萄糖蛋白胨水(MR和VP試驗(yàn)用)

A.7.1成分

多價(jià)胨

7.0g

葡萄糖

5.0g

磷酸氫二鉀

5.0g

蒸餾水

1000mL

A.7.2制法

溶化后調(diào)節(jié)

pH

至7.

0±0.2,分裝試管,每管1mL,121℃高壓滅菌15min,備用。

A.7.3甲基紅(MR)試驗(yàn)

A.7.3.1甲基紅試劑

A.7.3.1.1成分

甲基紅

10mg

95%乙醇30mL

蒸餾水

20mL

A.7.3.1.2制法

10mg甲基紅溶于30mL95%乙醇中,然后加入20mL蒸餾水。

A.7.3.1.3試驗(yàn)方法

取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中,

36℃±1℃培養(yǎng)2d~5d。滴加甲基紅試劑一

滴,立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽(yáng)性,黃色為陰性。

A.7.4V-P試驗(yàn)

A.7.4.16%α-萘酚-乙醇溶液

成分及制法:取α-萘酚6.

0g,加無(wú)水乙醇溶解,定容至100mL

。

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A.7.4.240%氫氧化鉀溶液

成分及制法:取氫氧化鉀40g,加蒸餾水溶解,定容至100mL。

A.7.4.3試驗(yàn)方法

取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中,

36℃±1℃培養(yǎng)2d~4d。加入6%α-萘酚-乙

醇溶液0.

5mL和40%氫氧化鉀溶液0.2mL,充分振搖試管,觀察結(jié)果。陽(yáng)性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出

現(xiàn)紅色,如為陰性,應(yīng)放在36℃±1℃繼續(xù)培養(yǎng)1h再進(jìn)行觀察。

A.8血瓊脂

A.8.1成分

蛋白胨

1.0g

牛肉膏

0.3g

氯化鈉

0.5g

瓊脂

1.5g

蒸餾水

100mL

脫纖維羊血

5mL~8mL

A.8.2制法

除新鮮脫纖維羊血外,加熱溶化上述各組分,

121℃高壓滅菌15min,冷到50℃,以無(wú)菌操作加入

新鮮脫纖維羊血,搖勻,傾注平板。

A.9糖發(fā)酵管

A.9.1成分

牛肉膏

5.0g

蛋白胨

10.0g

氯化鈉

3.0g

磷酸氫二鈉(Na

2HPO4·12H2O)2.0g

0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液12.0mL

蒸餾水

1000mL

A.9.2制法

A.9.2.1葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后,按0.5%比例加入葡萄糖,分裝于有一個(gè)倒置小管的小試管

內(nèi),調(diào)節(jié)

pH

至7.

4,115℃高壓滅菌15min,備用。

A.9.2.2其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后,分裝每瓶100mL,115℃高壓滅菌15min。另將各

種糖類(lèi)分別配好10%溶液,同時(shí)高壓滅菌。將5mL糖溶液加入于100mL培養(yǎng)基內(nèi),以無(wú)菌操作分裝

于含倒置小管的小試管中?；虬凑誂.

9.2.1葡萄糖發(fā)酵管的配制方法制備其他糖類(lèi)發(fā)酵管。

A.9.3試驗(yàn)方法

取適量純培養(yǎng)物接種于糖發(fā)酵管,

36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,觀察結(jié)果,藍(lán)色為陰性,黃色為

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陽(yáng)性。

A.10過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)

A.10.1試劑

3%過(guò)氧化氫溶液:臨用時(shí)配制。

A.10.2試驗(yàn)方法

用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)菌落,置于潔凈玻璃平皿內(nèi),滴加3%過(guò)氧化氫溶液2滴,觀

察結(jié)果。

A.10.3結(jié)果

于半分鐘內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性,不發(fā)生氣泡者為陰性。