1、,、微生物純培養(yǎng)技術(shù),純培養(yǎng)基本步驟：,(2) 培養(yǎng),(1) 分離,自生固氮菌的分離純化,細菌的分離純化,一、目的要求： 1、學習微生物純系分離、培養(yǎng)方法。 2、掌握劃線分離純化微生物的方法。 二、基本原理： 為了生產(chǎn)和科學研究的需要，往往需要從自然界混雜的微生物群中分離單一的菌種，這種獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離。,第一節(jié) 微生物純培養(yǎng),二、微生物純培養(yǎng)技術(shù),1、稀釋平板分離法：傾注平板法和涂布平板法。 基本過程：（1）梯度稀釋過程；（2）分離培養(yǎng)過程,涂布,傾注,梯 度 稀 釋 過 程,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng),、稀釋倒平

2、板法：稀釋不同稀釋液少許與50oC左右的瓊脂培養(yǎng)基混合傾入平皿。 2、涂布平板法：稀釋傾入平皿不同稀釋液少許涂布在瓊脂培養(yǎng)基。 3、平板劃線分離法：少許待分離物平板劃線（連續(xù)劃線和分區(qū)劃線）。 4、稀釋搖管法：待分離物用培養(yǎng)基稀釋搖勻在瓊脂表面封石蠟。,液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 同一稀釋度做多個平行管，95%表現(xiàn)為不生長 。,二、微生物純培養(yǎng)技術(shù),4) 操作要點： 無菌操作,稀釋平板分離法使用過程中的幾個問題,1) 梯度稀釋度的確定： 需分離微生物在樣品中的數(shù)量,2) 選擇菌落接種的依據(jù)： a、菌落特征； b、菌體的特征,3) 微生物純培養(yǎng)的標準： 菌落特征一致性,固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng),菌落:單個

3、微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞生長群體。 菌苔：當固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時。 平板（培養(yǎng)平板）：它是指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。,3、平皿劃線法 用接種環(huán)沾少許待分離的材料，在培養(yǎng)基表面進行多次平行劃線，使微生物細胞分開生長以獲得微生物純培養(yǎng)的過程。,2、單細胞挑取法： 從待分離材料中挑取一個細胞來培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)的過程。,單細胞（單孢子）分離,在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單細胞（單孢子）培養(yǎng)。 選擇培養(yǎng)分離 1、利用選擇培養(yǎng)基進行直接分離。 2、富集培養(yǎng)（多次培養(yǎng)后

4、再分離） 二元培養(yǎng)物：培養(yǎng)物中含 有二種微生物。 寄生物如病毒 ，原生動物如纖毛蟲。,為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，可采用下列兩種方法：一種是提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。如要從土壤中分離自生固氮菌，則其培養(yǎng)基中是不能含有N源，這種培養(yǎng)基就比較適于能利用空氣中N2的微生物。另一種方法是在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)，以抑制人們所不需要的微生物的生長繁殖。分離土壤中真菌，往往在分離真菌的馬丁培養(yǎng)基中加入適當?shù)拿霞永t，鏈霉素和金霉素等化學藥品，目的在于抑制細菌生長，這樣更有利于獲得其純培養(yǎng)。 tupian,土壤中微生物數(shù)量眾多，在肥沃土壤中固氮菌數(shù)量也很多，自然界中多數(shù)氮素養(yǎng)料是由

5、微生物固氮的結(jié)果，固氮菌一般可分為自生固氮菌和共生固氮菌兩類。 要分離自生固氮菌，常用阿斯畢無氮培養(yǎng)基這種選擇培養(yǎng)基，控制其適宜環(huán)境條件，使它在培養(yǎng)基上大量繁殖，然后通過稀釋法和劃線分離純化法，使它在培養(yǎng)基上形成單菌落，如分離所得不純，需要進一步純化，直到得到純種.,三、材料與儀器,1、培養(yǎng)基：阿斯畢無氮培養(yǎng)基。 2、菜園土。 3、滅菌培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀、接種針、酒精燈等,四、方法與步驟,（一）富集培養(yǎng)： :(上次已做實驗) 1、加入1ML土壤菌懸液于滅菌平板 2 、加入已滅菌后冷卻至50oC左右的阿斯畢培養(yǎng)基，混勻。 3、正面放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28oC培養(yǎng)34天后，在土粒周圍有混濁半透明的膠

6、狀菌落出現(xiàn)，有的在后期會產(chǎn)生褐色的色素。,（二）劃線分離純化,1、用已溶化至50oC阿斯畢培養(yǎng)基倒入平板。 2、用接種環(huán)挑取上述菌落少許，在冷凝平板上進行劃線分離，而后置28oC培養(yǎng)4天。 劃線方法如圖：,1,2,3,4,（三）純化、鏡檢，得到純種培養(yǎng),1、平板上出現(xiàn)單菌落，按無菌操作移入阿斯畢培養(yǎng)基斜面試管中，28oC培養(yǎng)4天。 2、鏡檢：將斜面菌株進行涂片、染色、鏡檢。如是粗短桿狀或球狀的單一形態(tài)的菌體細胞較大，常呈單個或“8”字排列，在細胞表面有較厚的莢膜者，即為自生固氮菌。如有雜菌，需要進一步劃線純化。 3、將得到純化菌株，移接到另一阿斯畢培養(yǎng)基斜面管，28oC培養(yǎng)34天，即獲得純培養(yǎng)菌，可冷凍保存，備用。,五、注意事項：,（1）在微生物分離、純化每一操作環(huán)節(jié)，要嚴格按照無菌操作進行。 （2）平板劃線時，劃線部位不可重疊。 （3）劃線時，每次都要將接種環(huán)上多余菌體燒掉。 （4）培養(yǎng)皿要貼標簽，包括班級、姓名,六、思考題