1、細(xì)胞器的熒光標(biāo)記,熟悉熒光標(biāo)記各種細(xì)胞器的常用方法及原理 掌握熒光顯微鏡下各種細(xì)胞器的形態(tài)及分布,膜相結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜 核被膜 線粒體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 高爾基體 溶酶體 過(guò)氧化物酶體,非膜相結(jié)構(gòu),細(xì)胞骨架,微管 微絲 中間纖維,核骨架，核纖層,細(xì)胞結(jié)構(gòu),染色質(zhì)，染色體，核仁，核糖體,4人一組,細(xì)胞核的熒光顯示 P60-62 線粒體的熒光標(biāo)記 P70 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光標(biāo)記 P64-67 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察,常用熒光染料的激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng),Fluorescent DyeExcitation （激發(fā)頻譜，nm） Emission （發(fā)射頻譜，nm） Cy2TM 489506 GFP(Red Shifted) 488

2、507 YO-PROTM-1 491509 YOYOTM-1 491509 Calcein 494517 FITC 494518 FluorXTM 494519 AlexaTM488 490520 Rhodamine 110496520 ABI,5-FAM 494522 Oregon Green TM 500 503522 Oregon GreenTM 488 496524 RlboGreenTM 500525 Rhodamine GreenTM 502527 Rhodamine123 507529 Magnesium GreenTM 506531 Calcium GreenTM 506533

3、 TO-PROTM-1 514533 TOTO-1 514533 ABI,JOE 520548,Fluorescent DyeExcitation （激發(fā)頻譜，nm） Emission （發(fā)射頻譜，nm） BODIPY530/550 530550Dil 549565BODIPYTMR 542568BODIPY558/568 558568BODIPY564/570 564570Cy3TM 550570TRITC 547572Magnesium OrangeTM 550575Phycoerythrin,R & B 565575Rhodamine Phalloidin 550575Calcium O

4、rangeTM 549576Pyronin Y 555580Rhodamine B 555580Rhodamine RedTM 570590Cy3.5TM 581596ABI,ROX 588608Calcium CrimsonTM 590615,Fluorescent DyeExcitation （激發(fā)頻譜，nm） Emission （發(fā)射頻譜，nm） Texas Red595615 Nile Red549628 YO-PROTM-3612631 YOYOTM-3612631 R-Phycocyanin618642 C-Phycocyanin620648 TO-PROTM-3642660 TO

5、TO-3642660 DiD DilC(5)644665 Cy5TM649670 Thiadicarbocyanine651671 Cy5.5675694,1. 細(xì)胞核的熒光顯示 P60-62,吖啶橙（Acridine Orange) 吖啶衍生物之一，它既可嵌入DNA雙鏈間與雙鏈DNA結(jié)合，經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后發(fā)出亮綠色熒光， 又可以靜電堆積的方式與單鏈DNA或RNA 的磷酸根結(jié)合，藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出橘紅色熒光，從而清晰的顯示DNA,RNA。,異染色質(zhì)（核內(nèi)深染）和常染色質(zhì)（核內(nèi)淺染）,實(shí)驗(yàn)方法: P62,1.將生長(zhǎng)有培養(yǎng)細(xì)胞的蓋玻片（注意細(xì)胞面向上）置于一次性小培養(yǎng)皿內(nèi)，加入95乙醇固定1530分鐘，取

6、出自然干燥； 2.加入1醋酸酸化30秒； 3.在蓋玻片標(biāo)本上滴加0.01吖啶橙染液，染色510分鐘； 4.去染液，用磷酸緩沖液沖洗1分鐘； 5.用1/10氯化鈣分化30秒3分鐘； 6.用PBS漂洗玻片3次，每次數(shù)秒； 7.臨時(shí)封片：滴12滴PBS于載玻片上，將含細(xì)胞的蓋玻片反扣其上，置熒光顯微鏡下用100X物鏡觀察。,細(xì)胞核呈綠色（DNA),細(xì)胞質(zhì)呈橙紅色。,2.線粒體的熒光標(biāo)記 P70,羅丹明123特異性的線粒體熒光染料, 是膜電位敏感的陽(yáng)離子熒光素，活細(xì)胞線粒體具有大量質(zhì)子積累造成的外正內(nèi)負(fù)跨膜電位，吸引染料并將它保持在線粒體中,經(jīng)藍(lán)光激發(fā),呈現(xiàn)黃綠色熒光.可作為線粒體膜電位的靈敏指示.,

7、羅丹明123結(jié)構(gòu)式,電子傳遞和氧化磷酸化的偶聯(lián),實(shí)驗(yàn)方法: P71,取出已培養(yǎng)好細(xì)胞的蓋玻片，用PBS(+)沖洗3次，每次漂洗浸泡2-3分鐘， 2. 加入羅丹明123標(biāo)記液， 37培養(yǎng)箱孵育15分鐘， 3.吸去標(biāo)記液，PBS液洗3次，每次3-5分鐘， 4.臨時(shí)封片：滴12滴緩沖液于載玻片上，將含細(xì)胞的蓋玻片反扣其上，置熒光顯微鏡下用100X物鏡觀察。,細(xì)胞核附近發(fā)綠色熒光的圓形或短桿狀顆粒即為線粒體,3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光標(biāo)記 P64-67,1.材料 培養(yǎng)細(xì)胞爬片 2. 試劑 儲(chǔ)存液：0.5mg/mL DIO-C6(3)存儲(chǔ)液，4避光， 標(biāo)記液：2.5ug/mL DIO-C6(3)， 4避光。 0.

8、5%戊二醛,實(shí)驗(yàn)方法: P67,取出已培養(yǎng)好細(xì)胞的蓋玻片，用0.5%戊二醛PBS溶液固定細(xì)胞10分鐘， 2.吸去固定液，用PBS液洗3次，每次漂洗時(shí)浸泡 3-5分鐘 2. 滴加DIO-C6(3)熒光染液，室溫染色1分鐘， 3.吸去標(biāo)記液，PBS液洗3次，每次5分鐘， 4.臨時(shí)封片：滴12滴緩沖液于載玻片上，將含細(xì)胞的蓋玻片反扣其上，置熒光顯微鏡下用100X物鏡觀察。,4.細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡（Apoptosis）又稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death簡(jiǎn)稱PCD），是由基因編程控制的細(xì)胞主動(dòng)參與的自殺過(guò)程，是一種生理性調(diào)節(jié)機(jī)制，與細(xì)胞壞死的死亡機(jī)制是完全不同。 細(xì)胞凋亡是細(xì)

9、胞衰老自然死亡的主要方式之一，在機(jī)體中承擔(dān)著重要的調(diào)控作用。它不僅在維持細(xì)胞群體數(shù)量的穩(wěn)定、胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)的克隆選擇方面，而且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、抗腫瘤藥物的治療等方面均具有十分重要的作用。,細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別,細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察 熒光顯微鏡觀察法Hoechst33258染色法,1. 材料：CHO細(xì)胞 2. 器材：細(xì)胞培養(yǎng)所需設(shè)備，熒光顯微鏡。 試劑 (1) 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑：放線菌素D 5mg粉劑用1mLDMSO（二甲亞風(fēng)）濃度(5mg/mL)充分溶解，分裝-20避光保存， (2) Hoechst33258染液：稱取Hoechst33258 1mg, 用20mL蒸餾水溶解，過(guò)濾，4避光保存

10、。用時(shí)用蒸餾水10倍稀釋成染色液，pH 7.0 (3)固定液：4%多聚甲醛 (4) PBS液,放線菌素D是一種抗腫瘤的抗生素類藥物。通過(guò)脫氧鳥(niǎo)苷殘基與DNA形成復(fù)合物，從而抑制DNA依賴的RNA聚合酶的活性，阻斷轉(zhuǎn)錄過(guò)程。是多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞強(qiáng)有力的凋亡誘導(dǎo)劑. 分子式: C62H86N12O16 分子量: M.W. 1255.5溶解度: 溶于 DMSO, MeOH 或CHCl3.，紅色晶體。,操作方法,1.貼壁細(xì)胞培養(yǎng)：將蓋玻片置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，接種細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜， 2.細(xì)胞換液并加入細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑：放線菌素D 2uL濃度(10ug/mL) 繼續(xù)培養(yǎng)24h， 3. 取出小培養(yǎng)皿，吸盡培養(yǎng)液，加入固定液(4%多聚甲醛)0.5mL固定10分鐘， 4.去固定液，用PBS液洗2次，每次3分鐘，洗滌時(shí)搖動(dòng)， 5. 吸盡液體，將蓋玻片正面向上放在載玻片中央，加入20uL Hoechst33258染色液，染色5分鐘， 6. 去染色液，蓋玻片置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，用PBS液洗2次，每次3分鐘，洗滌時(shí)搖動(dòng)， 7. 在載玻片中央加入1-2滴PBS液, 將蓋玻片反扣放在載玻片中央（長(zhǎng)有細(xì)胞的面向下），盡量避免氣泡產(chǎn)生，