1、植物離體受精研究概述,簡介,植物離體受精技術(shù)是利用分離方法將雌、雄配子置于離體控制條件下進行操作，完成被子植物的精卵融合而且利用受精所產(chǎn)生的離體“合子培養(yǎng)”再生植株，做到整個受精與胚胎發(fā)育過程完全在離體條件下完成?？膳懦w細胞組織的干擾，用于探索精、卵細胞的識別和合子的激活的問題。 此外離體受精操作有可能為單倍體育種、遠緣雜交、基因工程等應(yīng)用領(lǐng)域提供新的技術(shù)手段，現(xiàn)已成為植物發(fā)育生物學(xué)和植物生殖生物學(xué)的一個研究熱點。這樣的實驗系統(tǒng)的建立對基礎(chǔ)研究和高新技術(shù)研究均有重大意義。因此，把離體受精的成功看作植物受精研究史中的重要里程碑是沒有夸張的。,植物離體受精成功的技術(shù)基礎(chǔ)是：,1. 植物雌、雄性細

2、胞的分離,2. 植物雌、雄性細胞離體融合,3. 合子培養(yǎng)和新植株生成,一、 雌、雄性細胞的分離,從嚴(yán)格意義上講，性細胞是指直接參加受精作用的雌、雄配子，即精細胞與卵細胞。但就被子植物而言，精細胞與卵細胞的分離往往要從花粉與胚囊的分離入手，而且花粉與胚囊作為參與整個受精過程的單位具有明顯的性的特征，故將其納入廣義的性細胞范疇。 因此，雌、雄性細胞的分離可根據(jù)性質(zhì)是否相近分成三類，簡介已有的分離方法。,1.1花粉原生質(zhì)體與脫外壁花粉的分離 花粉粒被花粉外壁與內(nèi)壁所包圍，用人工方法脫去外壁和內(nèi)壁，可分離出僅有質(zhì)膜保護的花粉原生質(zhì)體;僅脫去外壁，保留了內(nèi)壁與原生質(zhì)體的結(jié)構(gòu)單位，可稱之為“脫外壁花粉”(

3、de-exined pollen)。,1.1.1花粉原生質(zhì)體的分離,花粉原生質(zhì)體兼有花粉與單倍性原生質(zhì)體雙重特性，具有重大研究價值。上世紀(jì)80年代中后期，探索出了三條分離花粉原生質(zhì)體的路線： 1.化學(xué)脫壁。用氧化劑、酸、堿、多糖試劑等多種化學(xué)試劑處理花粉外壁，但易導(dǎo)致原生質(zhì)體受損。 2.非酶法脫壁。據(jù)報道，用NaCl溶液滴加菜豆成熟花粉，能迅速釋放出原生質(zhì)體，但并未提供脫壁是否徹底的證據(jù)。 3.酶法脫壁。根據(jù)不同植物花粉的特點，使用酶降解外壁，這是目前唯一行之有效的路線。,花粉原生質(zhì)體的酶解脫壁與體細胞原生質(zhì)體分離時直接降解是不同的。 花粉壁包括外壁和內(nèi)壁。外壁的基本成分是孢粉素，是類胡蘿卜素

4、與類胡蘿卜素酯的氧化多聚化的衍生物，性質(zhì)十分堅固，至今尚無酶能加以降解。內(nèi)壁的基本成分是纖維素與果膠質(zhì)，可為常規(guī)細胞壁降解酶分解?？梢姡獗谑欠蛛x花粉原生質(zhì)體的主要障礙。因此需避開外壁，降解內(nèi)壁，促使原生質(zhì)體分離。,目前大致有四種分離方法： 1. 一步酶解法。該法適用于具寬大萌發(fā)溝花粉的植物?；ǚ壑糜诿敢褐?，通過水合膨脹，使外壁沿萌發(fā)溝裂開，內(nèi)壁大面積暴露，在酶作用下分解，釋放出原生質(zhì)體。 2. 水合酶解二步法。在上述工作基礎(chǔ)上，將水合與酶解分成二個步驟。第一步花粉在溶液中充分水合，使外壁裂開。第二步轉(zhuǎn)入酶液，降解內(nèi)壁，獲得原生質(zhì)體。,3.萌發(fā)酶解二步法。用上述方法不能分離煙草等植物的花粉原生

5、質(zhì)體，后建立此法：第一步將成熟花粉置于花粉培養(yǎng)基中，待花粉大量萌發(fā)，長出短花粉管時，及時轉(zhuǎn)入第二步，在酶液中酶解。由于花粉管尖端的壁為果膠質(zhì)與纖維素等物質(zhì)組成，酶液可開始降解花粉管壁，再擴展至花粉管內(nèi)壁，從而釋放出原生質(zhì)體。需要注意控制花粉管長度，過長時，易導(dǎo)致亞原生質(zhì)體的生成。,花粉,外壁,內(nèi)壁,酶液,花粉原生質(zhì)體,花粉管,4. 花藥預(yù)培養(yǎng)法。分離煙草幼嫩花粉原生質(zhì)體時可用此法。該法包括三個步驟：第一步將花蕾進行低溫預(yù)處理。第二步收集花藥，將之漂浮在液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)中花藥裂開，花粉釋放至培養(yǎng)基中，在繼續(xù)培養(yǎng)過程中大量花粉的外壁破裂。第三步將裂外壁花粉轉(zhuǎn)入酶液。 綜上所述，可知不同的花粉發(fā)育

6、時期，花粉的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理狀態(tài)均有變化，因此，分離方法與效果也可能因之變化。分離方法及各種細節(jié)也影響分離效果，如酶的種類、濃度，酶解時間等。,1.1.2 脫外壁花粉的分離,脫外壁花粉的分離主要是設(shè)法削弱與切斷外壁與內(nèi)壁的聯(lián)系，使外壁脫落。目前有三種方法： （1）低滲水合法。將花粉置于低滲溶液中水合，使外壁脫落。 （2）花藥預(yù)培養(yǎng)法。此法與分離煙草幼嫩花粉原生質(zhì)體方法相近，也經(jīng)過花蕾低溫預(yù)處理花藥漂浮培養(yǎng)酶解三個步驟。不同之處在于酶解時間大大縮短。酶解的作用是將裂開的外壁與內(nèi)壁之間尚存的局部聯(lián)系徹底切斷，從而分離出脫外壁花粉。,花粉置于水合液中，低溫下進行較長時間水合，削弱內(nèi)外壁聯(lián)系，同時保持活

7、力,花粉轉(zhuǎn)入較高溫度下作短時熱激處理,轉(zhuǎn)入低滲溶液作短時振蕩滲激處理,熱激與滲激促使外壁裂開以致脫落。低溫與熱激所用溫度、時間以及水合液、低滲液的滲透壓均能影響分離效果。該法能較好地保持脫外壁花粉生活力，顯著促進萌發(fā)。,3.低溫水合熱激滲激法,1.2 生殖細胞與精細胞的分離,生殖細胞與精細胞位于花粉?；蚧ǚ酃軆?nèi)，沉浸于營養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)中，以“細胞中的細胞”狀態(tài)存在。因此，只有將其分離后，呈原生質(zhì)體狀態(tài)時，才能進行直接的操作與研究。 其分離方法大致可分為兩類： 1.滲透壓沖擊法，利用低滲溶液促使花粉?；蚧ǚ酃芗舛似屏?，從而釋放出精細胞或生殖細胞。 2.機械分離法，利用機械力量使花粉破損，用以游離

8、出精細胞或生殖細胞；,機械力量,1.2.1生殖細胞的分離,由于各種植物花粉具有不同的生物學(xué)特性，因此為適用于不同的植物，生殖細胞的分離方法有四種： 1.一步滲透壓沖擊法?；ǚ壑糜诘蜐B蔗糖溶液中保溫一段時間后，花粉自行破裂，生殖細胞隨營養(yǎng)細胞質(zhì)流出，用此法分離出棉花生殖細胞。 2.二步滲透壓沖擊法。將花粉置于等滲溶液中培養(yǎng)，當(dāng)大部分花粉萌發(fā)時，加入蒸餾水使?jié)B透壓驟降，導(dǎo)致花粉管尖端破裂，釋放出生殖細胞。,3.低酶法。將花粉置于低濃度的酶液與低滲蔗糖溶液中保溫，促使花粉破裂釋放出生殖細胞。 4.花粉原生質(zhì)體釋放法。首先分離出花粉原生質(zhì)體，然后用滲透壓沖擊法或機械法使花粉原生質(zhì)體破裂，獲得生殖細胞。

9、,1.2.2 精細胞的分離,精細胞的分離與生殖細胞類似，但也各具特色。被子植物成熟花粉有兩種類型：三細胞花粉與二細胞花粉。三細胞花粉的營養(yǎng)細胞中含一對精細胞，而二細胞花粉的營養(yǎng)細胞中僅含一個生殖細胞，精細胞是在花粉管內(nèi)形成。因此，精細胞的分離方法因花粉類型而異。,三細胞花粉的精細胞分離主要有兩種方法： 1. 滲透壓沖擊法。將花粉置于含有一定濃度參透壓調(diào)節(jié)劑的介質(zhì)中，任其吸水后自行破裂而釋放精細胞。優(yōu)點是花粉壁不太破碎，碎片易于過濾清除但花粉發(fā)育時期與生理狀態(tài)對滲透壓沖擊效果有很大影響。 2.研磨法。有些植物花粉抗低滲，不易破裂。此時可選用研磨法。將懸浮于一定介質(zhì)中的花粉用玻璃勻漿器或其他裝置輕

10、輕研磨，使花粉破裂而又不損傷精細胞。優(yōu)點是手續(xù)簡便，不過分依賴花粉的成熟度與生理狀態(tài)。但研磨需要手工技巧，且研磨后花粉壁碎片較難清除。Fig 1.示分離的紫菜薹精細胞。,Fig 1 .紫菜薹精細胞的分離 （除A外，均為熒光二醋酸酯染色）A. Hoechst 33258染色，示花粉粒中一對精細胞；B. 剛分離的一對互相緊連的精細胞，其中一個具長尾狀延伸物（箭頭）；C. 一對分離的精細胞變?yōu)闄E圓球形，仍保持互相連接；D. 一對精細胞互相脫離，并變?yōu)閳A球形。,二細胞花粉的精細胞分離須待花粉管萌發(fā)出花粉管，生殖細胞已分裂成精細胞，然后從花粉管中分離精細胞。也有兩種方法： 1.花粉離體培養(yǎng)法?；ǚ墼谂囵B(yǎng)

11、基中人工萌發(fā)，待形成精細胞后，應(yīng)用滲透壓沖擊或研磨使花粉管破裂。但人工萌發(fā)的花粉管在精細胞形成上常不同步，由此分離的精細胞群體中不免混雜一些尚未分裂的生殖細胞，使精細胞純度降低。 2.活體離體法。這是較適宜的方法。將花粉授于柱頭上，切下花柱插入培養(yǎng)基，待眾多花粉管中已形成精細胞，花粉管自花柱切口長出，然后用滲透壓沖擊或酶法促使花粉管尖端破裂。該法分離的精細胞純度高，且接近受精前的發(fā)育狀態(tài)。,1.3 胚囊、卵細胞、合子與中央細胞的分離,卵細胞與中央細胞位于胚囊內(nèi)，胚囊又位于胚珠內(nèi)，被珠心與珠被包裹，胚珠外方還有子房壁包圍。因此，胚囊的分離程序一般先行人工解剖，除去子房壁，分離出胚珠。然后，由胚珠

12、中設(shè)法分離出胚囊。至于卵細胞、合子與中央細胞，或先經(jīng)由胚囊分離階段，再自胚囊中進一步操作，或由胚珠直接分離。,1.3.1 胚囊的分離,生活胚囊的分離一般采用酶法。將胚珠置于酶液中酶解，使珠被與珠心細胞離散，裸露出胚囊，一般需在酶解的基礎(chǔ)上，適當(dāng)輔以機械處理，如振蕩、擊打、壓片或解剖，以提高分離的效果。在有些情況下還能獲得卵細胞等胚囊成員細胞。 在胚囊分離實驗中所用的酶包括纖維素酶、果膠酶、蝸牛酶、半纖維素酶等。根據(jù)不同植物材料選用不同的酶類，其中纖維素酶與果膠酶最為常用。Fig 2.示煙草胚囊細胞的分離。,B,A,Fig 2. 煙草胚囊細胞的分離 分離出的單個胚囊及其組成細胞原生質(zhì)體，A示助細

13、胞(s)、卵細胞(e)、中央細胞(c)與反足細胞(a)；B示分離的卵細胞原生質(zhì)體，示助細胞(s)與卵細胞(e),1.3.2 卵細胞、合子與中央細胞的分離,如上所述，有時候，在分離胚囊的同時，也可能分離出胚囊成員細胞。它們一般呈原生質(zhì)體狀態(tài)。具體分離技術(shù)有多種，大致可分為三類： 1. 酶解法。以酶解為主要手段，輔以其他措施，可以分離出卵細胞、合子與中央細胞等。在上述酶解法分離胚囊的基礎(chǔ)上延長酶解時間，降解胚囊壁，可使卵細胞等逸出。 2. 解剖法。經(jīng)法不經(jīng)酶解，單獨用顯微解剖技術(shù)，直接從胚珠中分離卵細胞等。這主要在禾本科植物上獲得成功，如大麥，玉米等。,3. 酶解解剖法。胚珠先行酶解，再作顯微解剖

14、。該法在不少植物上分離出卵細胞、合子與中央細胞等。,玉米雌、雄性細胞分離圖,綜上所述，植物性細胞的分離技術(shù)通過多年的努力已取得長足的進步，在此基礎(chǔ)上，才能將研究重點轉(zhuǎn)入到性細胞的培養(yǎng)、融合、轉(zhuǎn)化等實驗系統(tǒng)的建立，并開展相關(guān)的細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)研究。但這并不能說已經(jīng)大功告成，還有很多空白有待填補。比如：迄今分離成功的植物材料還很有限；分離的首次成功和分離技術(shù)的完善化之間往往有距離，需不斷探索改進等。這些不足都嚴(yán)重制約著我們對植物有性生殖的認(rèn)識與控制。,二、 植物雌、雄性細胞離體融合,植物雌、雄配子體成功分離為性細胞的離體融合提供了有力的工具。從此，配子間的接觸、融合以及受精卵的發(fā)育可在人工已

15、知條件下進行，并可對其全部動態(tài)過程進行顯微追蹤觀察。但也應(yīng)對此系統(tǒng)進行正確的評價，從而使研究的重點由實驗系統(tǒng)的建立轉(zhuǎn)入利用離體受精系統(tǒng)探討雙受精的機制上面去。,2.1 性細胞形態(tài)與體積對離體融合的影響,2.1.1 形態(tài)的影響 無論經(jīng)酶解或直接解剖得到的卵細胞一般已無壁物質(zhì)，即為原生質(zhì)體，呈圓球形。而分離的精子雖無壁卻有兩種狀態(tài)：呈圓形和蝌蚪形。大多數(shù)精子一逸出即變圓，只有少數(shù)可較長時間保持尾狀結(jié)構(gòu)。據(jù)報道，兩種形態(tài)的精子在與卵細胞的融合過程中顯示出了差異。圓形精子與卵細胞粘連后通常停滯一段時間才開始真正細胞融合；而具尾精子一經(jīng)與卵粘連即很快完成融合，且融合成功率幾乎為100%。,離體條件下的配

16、子形態(tài)受環(huán)境溶液的滲透壓影響。據(jù)報道，在電融合時相對低滲的條件有助于提高融合率。稍低滲時，細胞充分膨脹，保持完美圓形，使得細胞間的接觸成為點接觸，這是電融合成功的必要條件。如下圖所示,稍低滲環(huán)境,正常環(huán)境,2.1.2 體積的影響,在各種性細胞融合中，精子中央細胞與生殖細胞中央細胞的離體融合頻率精、卵的離體融合頻率生殖細胞卵細胞融合頻率，這說明造成這一結(jié)果不是配子識別作用，而是其他原因。一個最可能的影響因素是融合雙方的細胞體積比。孫蒙祥等經(jīng)一系列實驗證實融合雙方體積比對融合起到重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)融合雙方體積懸殊且一方足夠小時，小原生質(zhì)體可一躍而入大者，速度快且效率高。但其作用機理尚不明確。可能與

17、某些物理因素如膜表面弧度和表面張力等有關(guān)。,2.2 融合過程中的細胞膜動態(tài),2.2.1 膜表面特點 利用膜表面特征可用于探討諸如配子粘連、識別和融合等問題，這對研究離體受精過程中可能的配子相互作用是至關(guān)重要的。對高等植物配子膜表面特征較直接的探索是關(guān)于對膜表面糖蛋白及其他凝集素受體的分離與標(biāo)記。一些實驗結(jié)果表明，受精會引發(fā)卵細胞表面蛋白的重新排布等現(xiàn)象。,2.2.2 融合過程中膜重組的方式,不同的體外受精系統(tǒng)中性細胞融合的原理不同，因而膜重組的方式也不盡相同。 電融合情況下精、卵細胞膜接觸點被電脈沖擊穿，精細胞質(zhì)很快進入卵細胞。顯然精細胞膜作為其中的一部分參與了受精卵細胞膜的重組。Fig 3示

18、玉米精卵電融合過程。,Fig 3. 玉米精卵電融合過程 A.在電場中精細胞（箭頭）與卵細胞粘連；B.電脈沖后精、卵細胞膜被擊穿，精細胞質(zhì)進入卵細胞。精細胞外側(cè)細胞膜與卵細胞膜相接（箭頭）；C.精卵融合近完成。此時仍可見精細胞質(zhì)區(qū)域；D.融合完成，精細胞質(zhì)已不可辨。箭頭處為精子融入位點。,PEG和CaCl2誘導(dǎo)的融合中性細胞的融合行為相似。以PEG誘導(dǎo)的融合為例，可將細胞膜在融合中的動態(tài)及融合產(chǎn)物膜重組的方式歸納為三類： A. 大小相似的兩性細胞間的融合，如卵細胞與中央細胞間的融合。兩細胞形始先相向壓縮成一個圓，此時兩細胞間的雙層膜仍把兩細胞的細胞質(zhì)隔開。以后膜消失，兩細胞合二為一。在這類融合中

19、兩細胞的細胞膜都參與形成了融合產(chǎn)物的細胞膜。,B. 大小懸殊的兩性細胞間的融合，如煙草生殖細胞與卵細胞、中央細胞與卵細胞間的融合。當(dāng)緊密粘連的兩細胞開始融合時，兩細胞在接觸點處已貫通，小細胞質(zhì)進入大細胞，這樣大小細胞膜均參與形成融合體的細胞膜。,C. 小如核質(zhì)體的細胞與大細胞的融合，如精細胞與卵細胞或中央細胞的融合。這種情況下小細胞整體進入大細胞，故小細胞膜并不參與融合產(chǎn)物細胞膜的形成。Fig 4示室溫下20%PEG誘導(dǎo)的玉米精卵細胞融合中精子被吞噬。,Fig 4. 室溫下20%PEG誘導(dǎo)的玉米精卵細胞融合中精子被吞噬 A.融合近完成，精子（箭頭處）已半入卵細胞；B.融合完成，精子輪廓仍可見（

20、箭頭處）；C.明視野加熒光圖像，示精子輪廓與熒光光環(huán)重疊；D.精子（箭頭處）周圍的卵細胞膜熒光。,2.2.3 卵細胞對多精入卵的反應(yīng),以鈣誘導(dǎo)的玉米精卵融合實驗中，曾測試了多精入卵的可能性。結(jié)果顯示，在第一次精卵融合后10-45min內(nèi)，第二個精子不能與受精卵融合。這被解釋為配子水平上存在著防止多精入卵的機制。進一步研究顯示，即使在電融合或PEG誘導(dǎo)的融合中，在一定的條件下也存在著受精卵再次與精子融合的困難，只有當(dāng)兩個精子彼此靠得足夠近時雙精入卵才易成功。,. 融合過程中的細胞質(zhì)動態(tài),2.3.1 融合對胞質(zhì)活動的影響 分離后的卵細胞、中央細胞除已無外壁外，所觀察到的細胞極性、胞質(zhì)運動狀態(tài)等細胞

21、學(xué)重要特征與分離前基本一致?；诖?，便可利用離體受精系統(tǒng)來測試精細胞的粘連和融合對卵細胞胞質(zhì)動態(tài)的影響。 精卵融合觸發(fā)的一個重要生理變化是卵細胞質(zhì)內(nèi)游離鈣的瞬間增加。在融合一段時間后，受精卵胞質(zhì)游離鈣才恢復(fù)到原初水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)配子融合激活了細胞膜鈣通道，使之開放，引起鈣流。這種現(xiàn)象始自精子進入位點附近并向受精卵的其余部分?jǐn)U散。這一結(jié)果表明高等植物受精卵的激活很可能與動物的類似，鈣信號傳導(dǎo)系統(tǒng)起了至關(guān)重要的作用。但這還需在更多物種中加以驗證。,2.3.2 受精卵中的胞質(zhì)重組,在體內(nèi)自然受精過程中，精細胞質(zhì)的傳遞因種而異，從已有證據(jù)來看，至少有部分被子植物的精細胞質(zhì)未能進入卵細胞。而在離體受

22、精時，精細胞質(zhì)則全部進入卵細胞。這為研究精細胞質(zhì)在受精卵中的命運、精細胞質(zhì)對卵細胞質(zhì)對卵細胞激活和發(fā)育的影響，以及兩性細胞質(zhì)間的相互作用及親和性提供了獨特的系統(tǒng)。 在離體受精條件下，雌、雄配子細胞質(zhì)匯合的時間進程因不同的融合方法、融合組合以及細胞狀態(tài)而有所不同。,在電融合時，由于電脈沖將兩配子粘連處的細胞膜擊穿，精細胞質(zhì)隨即進入卵細胞中。但匯集一處的兩性細胞質(zhì)并未立刻相容而重組。當(dāng)精核開始游離入卵細胞質(zhì)時，周圍界限逐漸模糊，直至精核本身被卵細胞質(zhì)包裹而不易追蹤，此時，可認(rèn)為受精卵細胞質(zhì)開始重組。 胞質(zhì)重組完成的形態(tài)學(xué)特征在有大量液泡的性細胞融合時較易掌握。如卵細胞與助細胞在低滲條件下的自發(fā)融合

23、。其重組完成的形態(tài)學(xué)標(biāo)志是分別來自兩個細胞的大液泡合二為一，形成新的中央大液泡。,A.精核開始游離入卵細胞質(zhì)時,B.精核被卵細胞質(zhì)所包裹，無法繼續(xù)追蹤,電融合時的胞質(zhì)重組,2.4 融合過程中的細胞核動態(tài),2.4.1 雄核在雌性細胞中的遷移 正常情況下雌雄核融合是配子融合后的必然階段。通過離體受精系統(tǒng)為觀察精核進入卵細胞或中央細胞后如何運動到細胞核與之接觸并融合提供了便利。,煙草中央細胞容易分離，且因具有大液泡，雄核進入后較易追蹤，是較好的觀察雄核運動的操作系統(tǒng)。以PEG誘導(dǎo)精子或生殖細胞與中央細胞融合時，可發(fā)現(xiàn)雄核有兩種運動形式： 1.雄核進入中央細胞立刻向一側(cè)滾動數(shù)微米后停止，幾秒后，又突然

24、向前運動。 2.雄核緩慢地從中央細胞內(nèi)側(cè)作向心的基本勻速緩慢運動。 這兩種運動前者快速而不連續(xù)，后者連續(xù)但緩慢，都與中央細胞內(nèi)細胞器狀顆粒的運動相似。由此推測雄核的運動可能是被動地隨胞質(zhì)流動而動。,2.4.2 核融合的生活動態(tài),為了進一步了解核融合本身需要多長時間，核融合的方式怎樣，核融合的動力學(xué)機制如何等一系列核融合的生活動態(tài)，在煙草中央細胞離體受精過程中發(fā)現(xiàn)： 1. 分離后的中央細胞內(nèi)各種內(nèi)含物以多種形式快速運動，顯示出旺盛的生活力。在顯微鏡下連續(xù)觀察30min仍可見活躍的胞質(zhì)運動。說明一定時間的持續(xù)顯微觀察對細胞生活力沒有明顯影響。 2. 中央細胞離體受精過程中精核首先與一個極核融合，然

25、后再與另外一個極核融合。 3. 核融合過程非?？欤谑覝貤l件下，僅以秒計。 4. 整個融合過程與一般細胞的PEG誘導(dǎo)融合過程相似。,5.在融合過程中始終可見兩性核仁，證明煙草中央細胞的受精屬于有絲分裂前期。 6.人工培養(yǎng)條件下雖與胚囊內(nèi)自然條件下有較大差異，但從核融合及胞質(zhì)運動的情況看其細胞內(nèi)微環(huán)境仍相對穩(wěn)定。融合后的中央細胞仍可進行核的分裂。表明其自然發(fā)育規(guī)律至少在早期階段并未因離體操作而有實質(zhì)性改變。,如前所述，核融合過程與細胞融合過程非常相似，但離體細胞融合是由各種誘導(dǎo)因素介導(dǎo)融合的，對于核融合是由什么介導(dǎo)的，目前有一種假說：首先是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在雌雄兩核間架橋，連接兩核的外膜。以后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短縮

26、使兩核靠近，并在兩核間形成甬道使兩核融合。這一假說是目前對核粘連與融合動力學(xué)的惟一解釋。但從雌雄核融合的生活狀態(tài)看應(yīng)至少有其他機制參與其中，以使兩核如此大面積粘連并快速融合。,2.5 精、卵融合的親和性,自離體受精系統(tǒng)建立以后，人們就提出利用這一技術(shù)克服不親和障礙，進行作物改良的設(shè)想，并希望開辟一條途徑以填補介于傳統(tǒng)有性雜交和體細胞雜交之間的空白。但大多雜交合子卻不能存活。這表明卵細胞作為外源基因的天然受體在細胞雜交中確有其優(yōu)越性，同時，在離體受精條件下進一步證實了遠緣雜交在配子融合過程中的不親和性。受精工程所能克服的應(yīng)是那些以花粉柱頭或花粉花柱相互作用為基礎(chǔ)的不親和障礙。,性細胞離體融合流程

27、圖,E：卵細胞 ；S：精細胞 ；Z：受精卵。,三、合子培養(yǎng)及受精前后卵細胞和中央細胞的培養(yǎng),合子培養(yǎng)直到20世紀(jì)90年代才有報道，但其發(fā)展最為迅速，技術(shù)最為完善，并已再生可育植株，隨培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進，將會有更多植物的合子培養(yǎng)獲得成功。卵細胞離體培養(yǎng)的結(jié)果不理想，還需深入研究，中央細胞的培養(yǎng)已有了良好基礎(chǔ)并在個別植物上取得了成功。,3.1 合子培養(yǎng),各種植物的合子在分離方法、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時發(fā)生的細胞學(xué)變化、發(fā)育過程和發(fā)育途徑等方面均有異同。 目前，惟一一例離體融合產(chǎn)生的合子培養(yǎng)獲得再生雜種植株是在玉米中實現(xiàn)的。研究表明，從離體受精到植株開花約需100天，形成的籽粒具有正常發(fā)育的胚和

28、胚乳。,3.2 卵細胞培養(yǎng),卵細胞的培養(yǎng)相對困難，但在外力的刺激和適當(dāng)?shù)臈l件下，卵細胞具有不經(jīng)受精即啟動胚胎發(fā)育的潛能，這將有助于在人工控制的條件下開展卵細胞的激活、分裂及孤雌生殖等相關(guān)研究，同時，作為單倍體的卵細胞，如能培養(yǎng)成功，可直接獲得單倍體植株，將為遺傳轉(zhuǎn)化和作物改良提供優(yōu)良的實驗體系。 對水稻而言，分離的卵細胞呈球形、無壁的原生質(zhì)體，開花前1-2天的卵細胞表現(xiàn)極性分布，細胞核和細胞質(zhì)位于一端，大液泡位于加一端；細胞質(zhì)索從中央向外周延伸，明顯可見。開花當(dāng)天極性消失，胞質(zhì)均勻分布，外周具多數(shù)小液泡。 Fig 5示水稻受精前后卵細胞的分離與合子培養(yǎng)。,Fig 5示水稻受精前后卵細胞的分離與

29、合子培養(yǎng) A.開花前2天的卵細胞原生質(zhì)體，呈現(xiàn)出明顯的極性分布，細胞質(zhì)和細胞核位于一側(cè)，另一側(cè)為大液泡； B.開花前1天的卵細胞原生質(zhì)體，仍呈現(xiàn)極性分布，但已減弱。 V：液泡,C.分離的一個卵細胞培養(yǎng)1天后3個細胞仍相互緊貼，卵細胞胞質(zhì)位于中央，色澤深，退化助細胞胞質(zhì)和核已消失，僅為具壁的空細胞，宿存助細胞胞質(zhì)稠密且均勻分布； D.開花后6h的合子原生質(zhì)體，細胞質(zhì)均勻分布，細胞核位于中央。 DS：退化助細胞；EC：卵細胞；PS：宿存助細胞。,E.合子培養(yǎng)1天后分裂成2個細胞，仍保持球形，箭頭指出分裂面； F.合子培養(yǎng)6天后分裂成多細胞球形原胚,3.3 中央細胞的培養(yǎng),從水稻中分離的中央細胞多數(shù)呈球形，細胞質(zhì)、細胞器、細胞核、大液泡和內(nèi)含物等呈極性分布。由于中央細胞體積較大，易于分離出多個亞中央細胞，因此，分離時須細心操作。 水稻受精后