1、生物技術(shù)專業(yè)系統(tǒng)實驗（四） 酶（蛋白質(zhì)）工程實驗II,二、-淀粉酶活力的測定 -國家標(biāo)準(zhǔn)GB 8275-2009,1.目的意義 2.實驗原理 3.試劑和溶液 4.儀器和器材 5.實驗方法 6.實驗報告 7.思考題,1.目的意義,淀粉是葡萄糖以-1,4糖苷鍵及-1，6糖苷鍵連結(jié)的高分子多糖，是人類和動物的主要食物，也是食品、發(fā)酵、釀造、醫(yī)藥、紡織工業(yè)的基本原料。 淀粉酶(amylase)是能夠水解淀粉分子鏈中的-1,4糖苷鍵，將淀粉鏈切斷成為短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，是淀粉粘度迅速下降的酶制劑。包括-淀粉酶、-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。它們廣泛存在于動物界、植物和微生物界。 除特殊的外，一般

2、淀粉酶對于生的淀粉不起作用，只作用于糊化后的淀粉。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。其中最重要的淀粉酶是-淀粉酶。,3D Structural of an -Amylase,-淀粉酶是淀粉及以淀粉為材料的工業(yè)生產(chǎn)中最重要的一種水解酶，其最早的商業(yè)化應(yīng)用在1984年，作為治療消化紊亂的藥物輔助劑。 -淀粉酶對淀粉的分解作用是工業(yè)上利用淀粉的基礎(chǔ)，如紡織工業(yè)上的退漿；酶法糖化制造葡萄糖、麥芽糖；酶法制造酒精、料酒等。 例如，生產(chǎn)葡萄糖需要葡萄糖淀粉酶，但僅有葡萄糖淀粉酶作用，不能液化淀粉溶液，葡萄糖的生成速度非常慢。此時，-淀粉酶的使用就成為必要條件。,-淀粉酶的活性測定，在理論研究和實際應(yīng)用中具有

3、重要的意義。 通過本實驗，學(xué)習(xí)一種測定-淀粉酶酶活力的方法，鞏固并熟練分光光度計的使用方法。,2.實驗原理,-淀粉酶能夠?qū)⒌矸鄯肿又械?1，4糖苷鍵隨機切成長短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對碘的呈藍(lán)色特性反應(yīng)逐漸消失，呈現(xiàn)棕紅色，其顏色消逝的速度與酶活性有關(guān)，可以用來表示淀粉酶水解的程度，因而能購?fù)ㄟ^反應(yīng)后溶液的吸光度值衡量酶的活力。,3.試劑和溶液,3.1 原碘液 稱取2.2g碘和4.4g碘化鉀完全溶解后定容至100ml，儲存于棕色瓶中（教師準(zhǔn)備）。 3.2 稀碘液 吸取原碘液2ml，加20g碘化鉀用水溶解并定容至500ml。 3.3 可溶性淀粉溶液 稱取2.000g（精確到

4、0.001g）可溶性淀粉于燒杯中，加適量蒸餾水調(diào)成漿糊狀物，邊攪拌邊加入沸水90ml，攪拌加熱至完全透明冷卻后定容至100ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。,3.4 磷酸緩沖液（pH6.0） 4.52g磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）和0.8g檸檬酸（C6H8O7H2O），定容至100ml。pH計校正后使用。 3.5 鹽酸溶液（0.1M/L） 100ml,4. 儀器及器材,4.1 儀器 電子天平 2臺 恒溫水浴鍋 每組 1臺 分光光度計 每組 1臺 記時器 每組 1臺,3.2 器材（每組） 15ml大試管10支 5ml移液管10支 1ml移液管5支 10ml移液管10支 比色皿1套（4個） 雙蒸水1瓶（5

5、0ml） 洗瓶1個 玻璃平皿1套 50ml小廣口瓶（棕色）2個 50ml 容量瓶 1個 100ml 容量瓶 1個 500ml 試劑瓶2個 100ml 試劑瓶2個 250ml 三角瓶2個 200ml燒杯2個 500ml燒杯1個 記號筆1支、吸耳球、稱量紙、藥勺、試管架、研缽、紗布,5.實驗方法 GB 8275-2009法,將淀粉作為底物，通過比色法測定碘顯藍(lán)反應(yīng)色值的減少以測定-淀粉酶活力的方法。,5.1 分析方法,5.1.1 待測酶液的制備 精確稱取1g酶粉，用少量pH6.0磷酸緩沖液充分溶解，將上清小心傾入容量瓶中，若有剩余殘渣，再加少量磷酸緩沖液充分研磨，最終樣品全部移入容量瓶中，用磷酸緩

6、沖液定容至100ml，搖勻。四層紗布過濾，濾液放置于4冰箱待用。 使用前 倍稀釋。,5.1.2 測定 A液：吸取20ml可溶性淀粉溶液于試管中，加入磷酸緩沖液5ml，充分混勻后，置于60 恒溫水浴中預(yù)熱5min B液：將1ml稀釋好的待測酶液加入A液，搖勻，立即計時，準(zhǔn)確反應(yīng)5min C液：將0.5ml 0.1mol/L鹽酸和5ml稀碘液加入試管中，搖勻待用 立即用移液器吸取1mlB液，加入預(yù)先盛有C液的試管中，搖勻 同時設(shè)置空白組（以1ml磷酸緩沖液取代1ml稀釋酶液） 于660nm波長下，用10mm比色皿迅速測定其吸光度值（A） 根據(jù)吸光度表C1，查得所測酶液的酶活力,5.1.3 計算酶活力 X=cn 其中：X樣品的酶活力，單位為u/g c測試酶液的酶活力，單位為u/g n樣品的稀釋倍數(shù),5.3 注意事項,酶反應(yīng)時間應(yīng)準(zhǔn)確計算。 試劑加入按規(guī)定順序進行。,6.實驗報告,