1、實(shí)驗(yàn)6 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測課標(biāo)解讀重點(diǎn)難點(diǎn)1.制備固定化-淀粉酶。 2.進(jìn)行淀粉水解的測定。3.通過此實(shí)驗(yàn)探討固定化酶的應(yīng)用價(jià)值。1.固定化酶的方法和優(yōu)點(diǎn)。2.固定化酶裝柱后的使用。一、酶與固定化酶1酶活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用的一類有機(jī)物，它是生物體內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)的催化劑。2固定化酶將水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。3將酶改造成固定化酶的原因由于酶在水溶液中很不穩(wěn)定，且不利于工業(yè)化使用，所以要將酶改造成固定化酶。4酶固定化的方法吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等。本實(shí)驗(yàn)用的是吸附法。5固定化酶作用的機(jī)理將固定化酶裝柱，當(dāng)?shù)孜?/p>

2、經(jīng)過該柱時(shí)，在酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。在酶固定化的各種方法中，哪一種方法對酶的作用影響較??？【提示】吸附法二、-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用檢測的實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)制備固定化-淀粉酶。(2)進(jìn)行淀粉水解作用的檢測。2實(shí)驗(yàn)原理將-淀粉酶固定在石英砂上，一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示劑測試，若流出物呈紅色，表明糊精生成。3本實(shí)驗(yàn)使用的酶及特性本實(shí)驗(yàn)使用的酶是枯草桿菌的-淀粉酶，其作用的最適pH為5.57.5，最適溫度為5075_。4實(shí)驗(yàn)材料及其制備(1)-淀粉酶的固定化：在燒杯中將5 mg -淀粉酶溶于4 mL蒸餾水中(由于酶不純，可能有些不溶物) 再加入5 g

3、石英砂，不時(shí)攪拌30 min 30 min后將上述溶液裝入1支注射器中(該注射器的下端接有氣門心，并用夾子封住) 用10倍體積的蒸餾水洗滌此注射器，以除去未吸附的游離淀粉酶，流速為1 mL/min(2)可溶性淀粉溶液：取50 mg可溶性淀粉溶于100 mL熱水中，攪拌均勻。(3)KI-I2溶液：稱取0.127 g碘和0.83 g碘化鉀。加蒸餾水100 mL，完全溶解后裝入滴瓶中。5實(shí)驗(yàn)步驟(1)淀粉溶液流經(jīng)固定化酶柱將灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，使該溶液以0.3 mL/min的流速過柱。(2)接取流出物待從固定化酶柱中流出5 mL淀粉溶液后，接收0.5 mL流出液

4、。(3)流出物鑒定在流出物中加入KI-I2溶液，觀察顏色。用水稀釋1倍后再觀察顏色。(4)洗滌、保存固定化酶柱實(shí)驗(yàn)后，用10倍柱體積的蒸餾水洗滌此柱。放置在4 冰箱中保存。(5)幾天后取出冰箱中該固定化酶柱，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，觀察結(jié)果。固定化酶柱為什么放在4 的冰箱中保存？【提示】高溫會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)，低溫不破壞酶的結(jié)構(gòu)。酶的固定化1.固定化酶的概念酶是生物體內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)的催化劑，具高度專一性和高效性，但酶在水溶液中很不穩(wěn)定，且不利于工業(yè)化使用。固定化酶就是將水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法固定在某種介質(zhì)(如石英砂、毛玻璃、瓊脂糖、明膠、海藻酸鈉、醋酸纖維素、聚丙烯酰胺等)上，使之成為不溶于水而又有酶活性

5、的制劑。2酶的常用固定化方法酶的固定化可分為酶分子固定化及細(xì)胞固定化。細(xì)胞固定化與直接固定酶相比，成本更低，操作也更容易。常用方法如下：(1)物理吸附法物理吸附法是指將酶吸附到固體吸附劑表面的方法，固體吸附劑多為活性炭、多孔玻璃、石英砂等。(2)化學(xué)結(jié)合法(包括交聯(lián)法及共價(jià)偶聯(lián)法等)化學(xué)結(jié)合法是指將酶分子相互結(jié)合，或?qū)⑵浣Y(jié)合到纖維素、瓊脂糖、離子交換樹脂等載體上的固定方式。工藝簡便及條件溫和是其顯著特點(diǎn)，其載體選擇范圍很大，涉及天然或合成的無機(jī)、有機(jī)高分子材料?；瘜W(xué)結(jié)合法中常見的有交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法、離子結(jié)合法等。(3)包埋法包埋法是指將酶包裹在多孔的載體中，如將酶包裹在聚丙烯酰胺凝膠等高分子

6、凝膠中，或包裹在硝酸纖維素等半透性高分子膜中。包埋法又分為凝膠包埋法和微囊化法，前者包埋成格子型，后者包埋成微膠囊型。固定酶的方法3直接使用酶和固定化酶的比較直接使用酶固定化酶酶的種數(shù)一種或幾種一種常用載體石英砂、高嶺土、皂土、硅膠、凝膠制作方法化學(xué)結(jié)合法固定化、物理吸附法固定化催化反應(yīng)單一或多種單一反應(yīng)底物各種物質(zhì)(大分子、小分子)各種物質(zhì)(大分子、小分子)缺點(diǎn)對環(huán)境條件非常敏感，易失活；難回收，成本高，影響產(chǎn)品質(zhì)量不利于催化一系列的酶促反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)催化效率高、耗能低、污染低既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離；可以反復(fù)利用4.固定化酶的優(yōu)點(diǎn)(1)可循環(huán)反復(fù)使用酶制劑。在某些情況下可使用上千次，極大

7、地降低了生產(chǎn)成本。(2)在生產(chǎn)中，可通過離心法或過濾法把酶與反應(yīng)液相互分開，在大規(guī)模的生產(chǎn)中所需工藝設(shè)備比較簡單易行。(3)穩(wěn)定性能好。下列與固定化酶相關(guān)的敘述中正確的是()A固定化酶是將水不溶性酶固定于某種介質(zhì)上，使之成為易溶于水，而又具酶活性的制劑B將固定化酶裝柱，當(dāng)酶流過該柱時(shí)，可催化柱內(nèi)底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物C酶固定的方法有吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等D固定化酶的缺點(diǎn)是酶在水溶液中很不穩(wěn)定，且易與產(chǎn)物混在一起不易分離【思路點(diǎn)撥】固定化酶就是將水溶性的酶用物理或化學(xué)方法固定在某種介質(zhì)上。使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。與普通酶相比，固定化酶易與產(chǎn)物分離，且固定化酶反應(yīng)柱中酶已被固定，

8、不能從柱內(nèi)流出；酶的固定化方法有吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等?！敬鸢浮緾關(guān)于固定化酶和一般酶制劑在應(yīng)用效果上的說法錯(cuò)誤的是()A固定化酶生物活性強(qiáng)，可長久使用B一般酶制劑應(yīng)用后和產(chǎn)物混在一起，產(chǎn)物的純度不高C一般酶制劑參加反應(yīng)后不能重復(fù)利用D固定化酶可以反復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)量和質(zhì)量【解析】固定化酶是將酶固定在不溶于水的載體上，使酶既能與反應(yīng)物接觸又能與產(chǎn)物分離，同時(shí)，固定在載體上的酶還可以被反復(fù)利用，降低成本，產(chǎn)物中也不含酶，提高了產(chǎn)品的純度，固定化酶雖可以多次利用，但不可長久使用。【答案】A固定化酶的應(yīng)用1.用固定化酶技術(shù)生產(chǎn)高果糖漿(1)高果糖漿生產(chǎn)中面臨的問題：高果糖漿

9、的生產(chǎn)需要使用葡萄糖異構(gòu)酶，它能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成果糖。這種酶的穩(wěn)定性好，可以持續(xù)發(fā)揮作用。但是，酶溶解于葡萄糖溶液后，就無法從糖漿中回收，造成很大的浪費(fèi)。(2)固定化酶反應(yīng)柱將酶固定在一種顆粒狀的載體上，再將這些顆粒裝在反應(yīng)柱內(nèi)，反應(yīng)柱底端裝上分布著許多小孔的篩板，酶顆粒無法通過小孔，而反應(yīng)溶液卻能出入。(3)使用固定化酶技術(shù)生產(chǎn)高果糖漿。生產(chǎn)過程中，將葡萄糖溶液從反應(yīng)柱的上端注入，使葡萄糖溶液流過反應(yīng)柱，與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸，轉(zhuǎn)化成果糖，從反應(yīng)柱的下端流出。(如圖所示) (4)相關(guān)技術(shù)優(yōu)勢：上述反應(yīng)柱能連續(xù)使用半年，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前，用固定化葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)

10、高果糖漿的規(guī)模已經(jīng)超過了每年1 000萬噸。2-淀粉酶的固定化(1)固定方法用吸附法將-淀粉酶固定在石英砂上。在燒杯中將5 mg -淀粉酶溶于4 mL蒸餾水中，再加入5 g石英砂，不時(shí)攪拌，30 min后，裝入1支下端接有氣門心并用夾子封住的注射器中(石英砂體積約4 mL)。用10倍體積的蒸餾水洗滌注射器以除去未吸附的游離淀粉酶。(2)固定化-淀粉酶功能檢測原理：淀粉糊精 (遇碘顯藍(lán)色)(遇碘顯紅色)麥芽糖葡萄糖(遇碘不顯色)檢測：用吸附法將-淀粉酶固定在石英砂上制成反應(yīng)柱后，將反應(yīng)柱(注射器)放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，當(dāng)一定濃度的淀粉溶液流經(jīng)反應(yīng)柱時(shí)，柱內(nèi)的-淀粉酶可使淀粉水解成糊

11、精用淀粉指示劑(KI-I2溶液)測試，流出物呈“紅色”表明有淀粉水解產(chǎn)物糊精的生成(未水解時(shí)，淀粉遇其指示劑應(yīng)顯示藍(lán)色)。固定化酶在消除污染、保護(hù)環(huán)境方面的應(yīng)用：固定化酶和固定化細(xì)胞在清除污染、保護(hù)環(huán)境方面也大有作為，是當(dāng)代環(huán)境保護(hù)的出色“衛(wèi)士”，其主要作用是進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測和處理三廢。環(huán)境監(jiān)測：固定化酶也可以用于測定有毒物質(zhì)的含量，進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測，如用固定化多酚氧化酶檢測水中的酚類物質(zhì)；利用固定化酶還可以檢測有機(jī)磷、有機(jī)氯農(nóng)藥等環(huán)境污染物(如過氯酸鹽、氧化物和尿素等)處理三廢：應(yīng)用固定化酶或固定化細(xì)胞可以組成快速、高效、連續(xù)運(yùn)行的污水處理系統(tǒng)，如用固定化分解氰化物的細(xì)菌除去廢水中的氰化物；用固定化

12、-淀粉酶處理造紙廠的廢水，用水解農(nóng)藥的細(xì)菌固定化制劑處理農(nóng)藥廢水等。下圖為固定化酶的反應(yīng)柱示意圖，請據(jù)圖回答：(1)請?jiān)跈M線上填出各標(biāo)號名稱。_，_，_。(2)與一般酶制劑相比，固定化酶的突出優(yōu)點(diǎn)是_。(3)的作用是_。(4)制作固定化葡萄糖異構(gòu)酶所用的方法有_或_。(5)據(jù)圖說出反應(yīng)柱的作用原理：_。【思路點(diǎn)撥】(1)固定化酶反應(yīng)柱是將酶固定在一種顆粒狀的載體上，再將這些顆粒裝在反應(yīng)柱內(nèi)，柱子底端裝上分布著許多小孔的篩板，酶顆粒無法通過小孔，而反應(yīng)液卻可出入，圖示中為反應(yīng)柱，為固定化酶，為具有小孔的篩板。(2)固定化酶的突出優(yōu)點(diǎn)是既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離。(3)多孔篩板的作用在于阻止

13、酶顆粒通過，但卻讓反應(yīng)液自由出入。(4)固定化酶可采用吸附法、交聯(lián)法等方法。(5)反應(yīng)柱的作用原理在于反應(yīng)物溶液從反應(yīng)柱上端注入后，使反應(yīng)物流過反應(yīng)柱與固定化酶接觸，參與催化化學(xué)反應(yīng)所形成的產(chǎn)物則從柱的底端流出?！敬鸢浮?1)反應(yīng)柱固定化酶分布著小孔的篩板(2)既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離，能連續(xù)性生產(chǎn)(3)酶顆粒無法通過，反應(yīng)溶液卻可自由出入(4)吸附法交聯(lián)法(5)反應(yīng)物溶液從反應(yīng)柱上端注入，使反應(yīng)物溶液流過反應(yīng)柱，與固定化酶接觸，得到的產(chǎn)物從反應(yīng)柱下端流出?！净?dòng)探究】若上述(例2)反應(yīng)柱中，所固定的酶為-淀粉酶，注入的溶液為一定濃度的淀粉溶液，請回答：(1)注入淀粉溶液后，反應(yīng)柱底端

14、流出物中主要成分是什么？你如何檢測淀粉是否被水解？現(xiàn)象如何？(2)該流出物溶液中是否具有-淀粉酶？為什么？如何通過簡單實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證你的結(jié)論？【提示】(1)流出物主要成分是糊精，可用淀粉指示劑檢測淀粉是否被水解，其現(xiàn)象是：水解前溶液呈藍(lán)色，水解后溶液呈紅色。(2)流出物溶液中無-淀粉酶，因?yàn)榉磻?yīng)柱底端的多孔篩板只允許反應(yīng)物溶液自由出入。而酶分子不能通過。為證明上述結(jié)論，可在裝入反應(yīng)物溶液前，先向柱內(nèi)加入蒸餾水，收集柱底端流出物溶液進(jìn)行淀粉水解實(shí)驗(yàn)加入蒸餾水后的流出物溶液不能將淀粉水解，表明其內(nèi)無淀粉酶。1下列不屬于酶固定化的方法的是()A吸附法B共價(jià)法C交聯(lián)法D包埋法【解析】本題考查酶固定化的方法

15、。酶固定化的方法比較多，其中包括吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法、包埋法等。本題四個(gè)選項(xiàng)中B項(xiàng)的方法描述不準(zhǔn)確?！敬鸢浮緽2固定化酶的優(yōu)點(diǎn)是()A有利于增加酶的活性 B有利于產(chǎn)物的純化C有利于提高反應(yīng)速度D有利于酶發(fā)揮作用【答案】B3將固定化酶裝柱后，當(dāng)?shù)孜锝?jīng)過該柱時(shí)，底物發(fā)生的變化是()A底物被稀釋了B底物被濃縮了C底物的結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定了D底物被酶水解成產(chǎn)物了【解析】固定化酶裝柱后，當(dāng)?shù)孜锝?jīng)過該柱時(shí)，底物被酶水解成產(chǎn)物了。所以只有D選項(xiàng)是正確的?！敬鸢浮緿4淀粉在各種酶的作用下會(huì)依次水解，不同階段的水解產(chǎn)物遇到指示劑會(huì)出現(xiàn)不同的顯色反應(yīng)，下列選項(xiàng)中屬于本實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)物質(zhì)和顯色現(xiàn)象的是()A淀粉遇

16、碘顯藍(lán)色B糊精遇KI-I2溶液顯紅色C麥芽糖遇碘不顯色D葡萄糖遇斐林試劑顯磚紅色【解析】本題考查本實(shí)驗(yàn)步驟中物質(zhì)的鑒定過程。該過程所依據(jù)的原理是淀粉流經(jīng)-淀粉酶固定化酶柱時(shí)，淀粉被酶水解成了糊精，而糊精遇到KI-I2溶液顯紅色。所以A、C、D選項(xiàng)中的反應(yīng)物質(zhì)都是錯(cuò)誤的，不是淀粉、麥芽糖、葡萄糖，而是糊精。只有選項(xiàng)B正確。【答案】B5回答下列有關(guān)固定化酶技術(shù)的問題。(1)酶是生物體中生化反應(yīng)的催化劑，在工業(yè)生產(chǎn)和食品加工中的應(yīng)用日益廣泛。為提高酶的利用率以及提高產(chǎn)品的純度，一般需要對酶進(jìn)行固定化處理：即將酶用物理或化學(xué)方法固定在_介質(zhì)上，具體方法有：吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、_法和交聯(lián)法。(2)下圖為裝有固定化酶a的實(shí)驗(yàn)裝置。其中b是反應(yīng)柱，c是催化底物。若裝置中的固定化酶為-淀粉酶，則通常是利用吸附法進(jìn)行固定的，介質(zhì)一般為_。利用該裝置進(jìn)行淀粉水解實(shí)驗(yàn)時(shí)，在漏斗中加入反應(yīng)液后的操作是_，以保證反應(yīng)充分。對流出的液體用_檢測，若呈現(xiàn)_色，說明淀粉被水解成糊精。若a是固定化酵母，要想得到較多的酒精，加入反應(yīng)液后的操作是_，裝置中的長導(dǎo)管起的作用是_。 (3)研究認(rèn)為，用固定化酶處理污染物是很有前途的，如將從大腸桿菌得到的磷酸三酯酶固定到尼龍膜上制成制劑，可用于降解殘留在土壤中的有機(jī)磷農(nóng)藥，與用微生物降解相比，其作用不需要適宜的_。A溫度 B水分CpHD營養(yǎng)【解析】(1)固