1、第十二章 核酶,第一節(jié) ribozyme 第二節(jié) 脫氧核酶,第一節(jié) ribozyme,一、ribozyme的發(fā)現(xiàn) 二、ribozyme的概念 三、ribozyme的種類 四、ribozyme研究進(jìn)展與展望,20世紀(jì)80年代初期，美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校的T.Cech 在研究四膜蟲 rRNA前體的剪接時發(fā)現(xiàn)，其 26S RNA 具有自我催化活性，由此提出了核酶的概念。 美國耶魯大學(xué)的S.Altman在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了RNase P具有生物催化功能，從而改變了生物催比劑的傳統(tǒng)概念。為此，T.Cech和S.Altman共同獲得了1989年度諾貝爾化學(xué)獎。,一、ribozyme的發(fā)現(xiàn),四膜蟲26S

2、rRNA前體內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子、外顯子的剪接點(diǎn),核酶的發(fā)現(xiàn)：內(nèi)含子的切除反應(yīng)發(fā)生在含有核苷酸和純化的26S rRNA前體而不含有任何蛋白質(zhì)催化劑的溶液中，可能的解釋只能是:內(nèi)含子切除是由26S rRNA前體自身催化的，而不是蛋白質(zhì)。 核酶的證實(shí)：將編碼26S rRNA前體DNA克隆到細(xì)菌中并且在無細(xì)胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄成26S rRNA前體分子。結(jié)果表明這種人工制備的26S rRNA前體分子在沒有任何蛋白質(zhì)催化劑存在的情況下，切除了前體分子中的內(nèi)含子。這種現(xiàn)象為自我剪接(self-splicing)，這是人類第一次發(fā)現(xiàn)RNA具有催化化學(xué)反應(yīng)的活性，,二、ribozyme概念,概念：具有催化功能

3、的RNA分子，是生物催化劑。 又稱核酸類酶、酶RNA、 核酶類酶RNA。 特點(diǎn)：核酶的作用底物可以是不同的分子, 或者作用 底物是同一RNA分子中的某些部位。 與蛋白質(zhì)酶相比：核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。,核酶的功能： 1.核苷酸轉(zhuǎn)移作用。 2.水解反應(yīng)，即磷酸二酯酶作用。 3.磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，類似磷酸轉(zhuǎn)移酶作用。 4.脫磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。 5.RNA內(nèi)切反應(yīng)，即RNA限制性內(nèi)切酶作用。,三、Ribozyme的種類,根據(jù)作用方式分為： 剪切型（把RNA前體的多余部分切除）， 剪接型（把RNA前體的內(nèi)含子部分切除并把不連續(xù)的外顯子部分連接起來）

4、 根據(jù)所作用的底物不同分為： 自體催化（催化分子內(nèi)反應(yīng)） 異體催化（催化分子間反應(yīng)）,I型內(nèi)含子:來源rRNA 剪接型核酶 II型內(nèi)含子:來源MT RNA 錘頭核酶:來源植物病毒 剪切型核酶 發(fā)夾核酶 自體催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶：來源人類病毒 RNase P：來源tRNA的成熟 異體催化,根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)和催化反應(yīng)： RNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物：核糖核酸酶P。 小分子的RNA：能夠進(jìn)行分子內(nèi)自我切割反應(yīng)，且不需蛋白質(zhì)參與。這些RNA分子可以分為兩個部分，一部分是底物，另一部分是酶。將具有酶活性的序列克隆后可制成人工核酶去作用于獨(dú)立的底物。 、型內(nèi)含子：將自身從前體mRNA中剪接出去的作用 共

5、同點(diǎn)：都涉及磷酸二酯鍵的切割或連接。它們作用的底物 是RNA，可以是RNA分子本身，也可以是別的RNA分子。,幾種能進(jìn)行自我剪切的RNA結(jié)構(gòu),小分子核酶常見類型：錘頭、發(fā)夾、HDV 催化特點(diǎn)：產(chǎn)生5-OH、2,3-環(huán)狀磷酸基末端,I型內(nèi)含子剪接， 圖中的pG可以是GTP、GDP或是GMP 特點(diǎn)：I型需要游離的鳥苷或其磷酸化的衍生物的參與，剪接過程中，內(nèi)含子先以 線性形式被釋放，然后再轉(zhuǎn)變成一個片段和一個環(huán)狀分子。, 型 內(nèi) 含 子 剪 接,特點(diǎn)：型內(nèi)含子的切除要形成套索結(jié)構(gòu)，以套索的形式釋放內(nèi)含子,四、Ribozyme研究進(jìn)展與展望,對各種已知ribozyme結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究。 可找出其結(jié)

6、構(gòu)功能域和必需基團(tuán)，據(jù)此可進(jìn)行分子 改造，以獲得分子更小的、高效的ribozyme 。 研究熱點(diǎn)：從催化分子內(nèi)反應(yīng)的自我剪切ribozyme設(shè) 計(jì)出催化分子間反應(yīng)的ribozyme。,1、抗病毒方面的研究,HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，是核酶應(yīng)用研究的理想靶標(biāo)。HIV主要攻擊T淋巴細(xì)胞，破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使抗病能力降低，導(dǎo)致死亡。 Wong等(1998) 利用發(fā)卡型核酶抑制HIV-1 基因表達(dá)，在一期臨床試驗(yàn)中，用帶有發(fā)夾狀核酶的載體體外轉(zhuǎn)染患者的T細(xì)胞, 然后再將這些T 細(xì)胞重新輸入到患者體內(nèi)，結(jié)果顯示患者體內(nèi) HIV-1 的滴度降低。 在的二期臨床試驗(yàn)中，Mit suyasu等(2009) 用

7、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將抗HIV核酶導(dǎo)入到造血干細(xì)胞中，然后將造血干細(xì)胞注入到感染 HIV 的患者體內(nèi)，結(jié)果38名患者攜帶了該種療法所使用的完整拷貝。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), CCR5是HIV-1 R5 毒株的重要細(xì)胞復(fù)合受體之一，該受體在 HIV-1感染初期起重要的作用，但是它的缺失對宿主是無關(guān)的，因此CCR5 可作為核酶切割的理想靶點(diǎn)。,HBV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。其生活史如下： HBV進(jìn)入肝細(xì)胞 在宿主酶作用下以負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈DNA 形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA 在宿主RNA聚合酶作用下合成mRNA(亦稱前基因組RNA, pgRNA) 在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成負(fù)鏈DNA 在HBV DNA 聚合酶作用下合

8、成正鏈DNA 形成子代閉合環(huán)狀DNA。 由于 HBV 的復(fù)制必須經(jīng)過RNA 的過程，所以可設(shè)計(jì)特異性核酶用于切割 RNA，從而阻斷HBV 的復(fù)制過程。,Fritz 等(1992) 合成了針對HBV pgRNA 的3個不同的核酶，直接作用于體外轉(zhuǎn)錄獲得的 HBV 的pgRNA，結(jié)果顯示這3個核酶都能準(zhǔn)確地切割底物RNA，表明HBV RNA易被核酶切割。 欒中華等(2005)將HDV 核酶基因序列構(gòu)建到原核載體中, 并轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 通過 ELISA檢測和定量PCR 測定載體的抑制效果，篩選出了兩種抑制效率高的 HBV 核酶, 抑制率達(dá) 68%。 王傳璽等(2007)將 HBV核酶基因轉(zhuǎn)入重組逆轉(zhuǎn)錄病

9、毒載體pMSCV/ U6 中，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株等方法，構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在包裝細(xì)胞系中能生產(chǎn)高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒，有效抑制 HepG2215 細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制。,2、核酶的抗腫瘤作用,針對多藥耐藥性基因設(shè)計(jì)核酶 多藥耐藥性( mult idrug resistnce, MDR) 是指腫瘤細(xì)胞對一種化療藥物表現(xiàn)出耐藥性，同時對其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用靶點(diǎn)亦不相同的化療藥物也表現(xiàn)出交叉耐藥的現(xiàn)象，是通過化療藥物治療腫瘤急需突破的一大難題。,Hiroyuki(1993)設(shè)計(jì)一個特異性切割MDR1 mRNA 序列的錘頭狀核酶，在體外對 MDR1 mRNA進(jìn)行切割，顯示錘

10、頭狀核酶能切割MDR1 mRNA 且使MDR恢復(fù)顯性。 Wang等(2003) 設(shè)計(jì)并合成一個抗MDR1的錘頭狀核酶，由一個含有RNA 聚合酶啟動子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其輸送到人肝癌細(xì)胞系HepG2 中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了錘頭狀核酶的細(xì)胞對阿霉素敏感，并有MDR1表達(dá)量的降低。這說明無論用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還是用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染抗 MDR1 的核酶都有可能有選擇的適用于MDR 的治療。 Gao等(2007) 在體外使重組核酶僅在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，而在非乳腺癌細(xì)胞中不表達(dá)；化學(xué)敏感性評估結(jié)果顯示在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，對阿霉素的抗藥性降低了15倍, 對長春花堿的抗藥性降低32倍。,核酶展望,核酶能切割致病基因的mRN

11、A，通過使其mRNA 斷裂來抑制致病基因的翻譯及表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)防及治療疾病的目的； 核酶具有高度的特異性, 它只對能與其互補(bǔ)的mRNA 發(fā)揮切割作用，而對宿主細(xì)胞沒有任何副作用，因此它是極安全的基因治療工具。,1、核酶的本質(zhì)是RNA分子，極易被RNA 酶降解。如何能提高核酶的穩(wěn)定性？ 2、要使核酶發(fā)揮最佳的催化活性，必須解決時間和空間問題，既要使核酶在合適的時間表達(dá)，還要使核酶及其切割底物在細(xì)胞的某一特定空間相互作用。 3、核酶的催化作用還依賴于病毒的滴度在病毒滴度低的時候其切割活性明顯，病毒滴度較高時，其切割活性顯著降低。,？,第二節(jié) 脫氧核酶,一、概念 利用體外分子進(jìn)化技術(shù)合成的一種具有

12、有高效的催化活 性和結(jié)構(gòu)識別能力的單鏈DNA片段。 同單鏈RNA分子一樣，能進(jìn)行折疊、催化和展現(xiàn)酶活 性。未發(fā)現(xiàn)自然界中存在天然的脫氧核酶。 根據(jù)催化功能的不同，可以將脫氧核酶分為5大類： 切割RNA的脫氧核酶、 切割DNA的脫氧核酶、 具有激酶活力的脫氧核酶、 具有連接酶功能的脫氧核酶、 催化卟啉環(huán)金屬螯合反應(yīng)的脫氧核酶。,脫氧核酶分子的構(gòu)建是通過擴(kuò)增事先固定在固相載體上的具有自我裂解功能的活性分子實(shí)現(xiàn)。,1、建立具有多樣性的DNA分子庫，其中的每一條分子兩端的序列固定； 2、利用針對這些序列的PC R 引物進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物時，使PCR 產(chǎn)物的一條鏈上 5-C端帶上生物素, 并插入一個三磷酸核苷，將這些嵌合分子通過5-C端的生物素固定在固相載體上，給予一定的條件使其進(jìn)行自我裂解； 3、具有裂解功能的分子鏈內(nèi)裂解后, 從固相載體上脫離下來