1、第二章大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和特殊生物反應(yīng)器，廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，為什么？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在生產(chǎn)生物工程產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)，特別是功能性蛋白質(zhì)： 1)同源性，直接翻譯后加工，蛋白質(zhì)可以直接折疊成正確的構(gòu)象2)有利于產(chǎn)品分離和純化，市場(chǎng)需求：目前，世界范圍內(nèi)蛋白質(zhì)治療藥物的快速增長(zhǎng)和市場(chǎng)需求已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了現(xiàn)有的生產(chǎn)能力。為了縮短產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)時(shí)間，加快產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，在利用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白和抗體的工藝選擇中，應(yīng)考慮利用成熟的產(chǎn)業(yè)化支撐技術(shù)平臺(tái)。目前，美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的生物技術(shù)產(chǎn)品和公開(kāi)的生產(chǎn)工藝具有攪拌生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的主流優(yōu)勢(shì)，工藝設(shè)計(jì)為補(bǔ)料分批或灌注培養(yǎng)。其大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)面臨的挑戰(zhàn)是獲

2、得最大生產(chǎn)率，同時(shí)注意保持產(chǎn)品質(zhì)量；消除所有培養(yǎng)環(huán)境中外源因素的污染，更準(zhǔn)確有效的過(guò)程控制手段，限制氧氣和控制大規(guī)模培養(yǎng)中溶解CO2的濃度積累等。一種特殊而有前途的生物反應(yīng)器，動(dòng)物奶泉生物反應(yīng)器。在第一部分中，有兩種類型的動(dòng)物細(xì)胞：1)非粘附依賴細(xì)胞(血液、淋巴組織和腫瘤組織)，2)粘附依賴細(xì)胞(大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多非整倍體細(xì)胞)，培養(yǎng)方法1，單層培養(yǎng)2，懸浮培養(yǎng)3，固定單層培養(yǎng)，概念：粘附依賴細(xì)胞可以迅速擴(kuò)散，開(kāi)始有絲分裂，并且當(dāng)它們附著在培養(yǎng)物的壁上時(shí)迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。這種培養(yǎng)方法稱為單層培養(yǎng)。大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都是這樣培養(yǎng)的。一、單層培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)：的優(yōu)點(diǎn)是表面積/體

3、積比大；微載體懸浮在培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境均勻，便于監(jiān)控；培養(yǎng)基利用率高；取樣重復(fù)性好；收獲過(guò)程并不復(fù)雜；放大更容易；勞動(dòng)強(qiáng)度低，占用空間小。2。懸浮培養(yǎng)，概念：是指細(xì)胞在培養(yǎng)箱中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程。它主要用于非附著依賴性細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞，它是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的；微生物發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)可以借鑒；因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞相對(duì)脆弱，在攪動(dòng)和通風(fēng)條件下，它們必須比微生物培養(yǎng)物溫和。3.固定化培養(yǎng)，概念：使用固定化方法，如吸附或包埋，將細(xì)胞限制在一定的空間，然后用固定化顆粒進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。該方法適用于貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞。常用的包埋培養(yǎng)方法3360用海藻酸鈣包埋非粘附細(xì)胞。膠原包埋通常用于粘附依賴性細(xì)胞

4、。第二節(jié)將動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作模式分為五種：批次、補(bǔ)料批次、半連續(xù)、連續(xù)和灌注。第一，批量操作：概念：將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性放入反應(yīng)器中培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)并形成產(chǎn)物。一段時(shí)間后，整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)被取出。培育過(guò)程：滯后期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、穩(wěn)定期和衰退期優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，容易掌握，是最常用的方法；缺點(diǎn)：不可能始終將細(xì)胞保持在最佳條件下。2.補(bǔ)料分批操作：概念：首先，將一定量的培養(yǎng)液放入反應(yīng)器中。在培養(yǎng)過(guò)程中，隨著細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷加入反應(yīng)器中，以進(jìn)一步代謝細(xì)胞。當(dāng)反應(yīng)終止時(shí)，取出整個(gè)反應(yīng)體系。特點(diǎn)：1)能調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度；2)反應(yīng)體積在整個(gè)過(guò)程中發(fā)生變化。有兩種喂養(yǎng)方

5、式：無(wú)反饋控制喂養(yǎng)：反饋控制喂養(yǎng)：最常見(jiàn)的喂養(yǎng)物質(zhì)：葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源；3.半連續(xù)操作(重復(fù)分批和換液培養(yǎng)):概念：在分批培養(yǎng)操作的基礎(chǔ)上，不是所有的反應(yīng)系統(tǒng)都被取出，其余的用新的營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充，然后以分批方式培養(yǎng)，反應(yīng)器中培養(yǎng)液的總體積，優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)液可以重復(fù)收獲，這對(duì)于培養(yǎng)基因工程動(dòng)物細(xì)胞分泌有用的產(chǎn)物或病毒更為實(shí)用。4.連續(xù)操作：概念：在培養(yǎng)過(guò)程中，一方面不斷向反應(yīng)器中加入新鮮的培養(yǎng)液，另一方面不斷取出反應(yīng)液，使反應(yīng)條件處于恒定狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：始終保持細(xì)胞處于最佳狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成；細(xì)胞生理和代謝的研究是重要的手段。5.灌注操作培養(yǎng)：概念：在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，一方面不斷加入新鮮培

6、養(yǎng)基，另一方面不斷取出反應(yīng)液，但細(xì)胞仍留在反應(yīng)器中，使細(xì)胞處于恒定的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)過(guò)程可保持穩(wěn)定狀態(tài)，代謝廢物低于抑制水平。第三部分是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的放大，從實(shí)驗(yàn)室到大規(guī)模培養(yǎng)：篩選和開(kāi)發(fā)能夠表達(dá)所需產(chǎn)物的細(xì)胞系；確定方瓶或旋轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞系對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境的要求；將細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器中，利用實(shí)驗(yàn)室小生產(chǎn)規(guī)模的臺(tái)式反應(yīng)器確定最佳操作模式和培養(yǎng)條件。擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模：緊密結(jié)合中試工藝，解決實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題。細(xì)胞生長(zhǎng)有六個(gè)限制：1 .培養(yǎng)基組成：血清是目前細(xì)胞培養(yǎng)基中不可缺少的成分，它提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的激素、轉(zhuǎn)移蛋白和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，已成為優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)和降低成本的主要障礙。減少血清

7、量和使用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。血清培養(yǎng)基的主要缺點(diǎn)及其原因：血清是培養(yǎng)基成本的主要部分；血清含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的微量成分，但這些成分的成分和功能仍不清楚，因此無(wú)法替代；血清的存在是產(chǎn)品純化的主要障礙。血清是病毒污染和其他未知因素的主要來(lái)源，這增加了細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的潛在使用危險(xiǎn)；血清也有抑制生長(zhǎng)的作用。血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)過(guò)程難以標(biāo)準(zhǔn)化。2.培養(yǎng)條件優(yōu)化控制困難：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞密度低的主要原因是培養(yǎng)條件和優(yōu)化控制困難，包括：細(xì)胞代謝產(chǎn)物乳酸、氨等的毒性。營(yíng)養(yǎng)耗盡時(shí)接種細(xì)胞的最小密度；問(wèn)題的解決是通過(guò)過(guò)程控制實(shí)現(xiàn)的：灌注系統(tǒng)、液體交換、進(jìn)料等。其中灌注是最好的方法。同時(shí)，采用合

8、理的培養(yǎng)體系，增加表面積，提供最佳的理化環(huán)境。3.污染控制：污染源包括細(xì)胞種子、血清、試劑、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作人員。污染控制始于細(xì)胞種子及其保存。滅菌方法的改進(jìn)是關(guān)鍵-血清？高溫滅菌培養(yǎng)基的研究：設(shè)備的合理設(shè)計(jì)和操作人員的培訓(xùn)至關(guān)重要。4.產(chǎn)品表達(dá)的控制：?jiǎn)栴}：細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳條件不一定是表達(dá)產(chǎn)品的最佳條件？解決辦法在于上游分子生物學(xué)的研究。5.硬件和工藝設(shè)計(jì)中的問(wèn)題：細(xì)胞培養(yǎng)條件(溫度、溶解氧、二氧化碳、酸堿度、滲透壓)的控制，其中充分的氧轉(zhuǎn)移是所有生物反應(yīng)器中的常見(jiàn)問(wèn)題；然而，動(dòng)物細(xì)胞的其他條件的可接受范圍相對(duì)狹窄。消除污染；遏制潛在生物毒物的傳播；提供足夠的表面積；培養(yǎng)過(guò)程中剪切力的控制(攪拌

9、、通氣、收獲)。產(chǎn)品的收獲目前，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的產(chǎn)量很低，不到總蛋白的1%，主要是由于血清蛋白的污染；細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的濃度低；該產(chǎn)品在培養(yǎng)條件下不穩(wěn)定。解決方法：使用無(wú)血清培養(yǎng)基；開(kāi)發(fā)在無(wú)血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的方法；開(kāi)發(fā)篩選技術(shù)以獲得高產(chǎn)細(xì)胞克隆；開(kāi)發(fā)產(chǎn)品分離技術(shù)：親和柱、中空纖維、微膠囊等。第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)必須滿足的條件：生物因素；化學(xué)因素；傳質(zhì)系數(shù)；傳熱系數(shù)；安全因素；操作因素；反應(yīng)器類型；操作模式；控制模式；攪拌方式可以概括如下：1 .生物反應(yīng)器類型：懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器；攪拌罐；中空纖維管；陶瓷矩形通道蜂窩生物反應(yīng)器、單層培養(yǎng)、攪拌罐(微載體系統(tǒng))中空纖維管陶瓷矩形通道蜂窩生物反應(yīng)器、包埋培養(yǎng)、流化床固定床、氣升式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器：優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品湍流溫和均勻，剪切力相當(dāng)小，對(duì)細(xì)胞損傷小，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分分布均勻。一般來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生的泡沫不多。中空纖維管生物反應(yīng)器：特點(diǎn)：纖維一般是水平的；優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用廣泛，細(xì)胞密度高，培養(yǎng)基和細(xì)胞分布均勻，長(zhǎng)期運(yùn)行，曝氣攪拌生物反應(yīng)器，無(wú)氣泡攪拌反應(yīng)器，動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器控制，溶解氧控制：適合動(dòng)物培養(yǎng)攪拌，加入少量與大溶解氧不混溶的溶劑，改變引入氣體的氮氧比；酸堿度控制：采用CO2/氫氧化鈉緩沖體系控制，避免局部極端酸堿度；溫度和攪拌速度的控制相對(duì)簡(jiǎn)單?；仡?/p>