中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

飼料中含硫氨基酸測定方法

-一離子交換色譜法

GB/'f15399一94

Determinationofsulfur

-ionexchange

aminoacidsinfeedstuffs

chromatography

1主題內(nèi)容與適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中含硫氨基酸的測定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于單一飼料、配合(混合)飼料及濃縮飼料。

2引用標(biāo)準(zhǔn)

GB/T6432飼料粗蛋白質(zhì)測定方法

GB/T6439飼料水溶氯化物測定方法

3原理

飼料中的含硫氨基酸(朧氨酸、半朧氨酸和蛋氨酸)用過甲酸氧化并經(jīng)鹽酸水解生成磺基丙氨酸和

蛋氨酸礬，此二產(chǎn)物可用離子交換色譜法分離測定。

4試劑

除特別注明者外，所有試劑均為分析純，水為去離子水，電導(dǎo)率小于1MS

4.1過甲酸溶液

4.1.1常規(guī)過甲酸溶液:將30%過氧化氫(GB6684)與88%甲酸(HG3-1296)按1:9(V/V)混合，于

室溫下放置1h，置冰水浴中冷卻30min，臨用前配制。

4.1.2濃縮料用過甲酸溶液:將常規(guī)過甲酸溶液中按3mg/mL加入硝酸銀(GB670)即可。此溶液適

用于氯化鈉含量小于3%的濃縮料。

當(dāng)濃縮料中氯化鈉含量大于3%時，氧化劑中硝酸銀濃度可用下式計(jì)算:

C,)1.454XmX蛛··························.??(1)

式中:C,—過甲酸中硝酸銀的濃度，mg/mL;

C}—樣品中氯化鈉含量，mg/mL;

?！獦悠焚|(zhì)量,mg,

4.2氧化終止劑

4.2.148氫澳酸(GB621)

4.2.2偏重亞硫酸鈉溶液:33.6g偏重亞硫酸鈉(HG3-909)加水定容至100ML

4.3酸解劑

國家技術(shù)監(jiān)督局1994一12一30批準(zhǔn)

1995一07一01實(shí)施

GB/T15399一94

4.3.16.0mot/L鹽酸溶液:將優(yōu)級純鹽酸(GB622)與水按1:1(V/V)混合。

4.3.26.8mol/L鹽酸溶液:將優(yōu)級純鹽酸(GB622)1133mL加水稀釋重2000ml。

4.47.5mol/L氫氧化鈉溶液:取優(yōu)級純氫氧化鈉(GB629)30g，加水溶解并定容至100ml-

4.5稀釋上機(jī)用檸檬酸鈉緩沖液，pH2.2,0.2mol/LNa:稱取檸檬酸三鈉(HG3-1298)19.6g，用水

溶解后加入優(yōu)級純鹽酸16.5mL，硫二甘醇5.0mL,苯酚(HG3-1165)1g，最后加水定容至

1000ml,，用G4垂熔玻璃砂芯漏斗過濾。

4.6不同pH及離子強(qiáng)度的洗脫用檸檬酸鈉緩沖液:按儀器說明書配制。

4.了荀三酮溶液:取茍三酮適量，按儀器說明書配制。

4.8磺基丙氨酸一蛋氨酸礬標(biāo)準(zhǔn)貯備液,2.50pmol/mL:準(zhǔn)確稱取磺基丙氨酸105.7mg和蛋氨酸礬

113.3mg，加水溶解并定容至250mL.

4.9氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液:含有L一天門冬氨酸、L一蘇氨酸等17種常規(guī)蛋白質(zhì)水解分析用L-A基酸，

各組份濃度為2.50pmol/ml-

4.10混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液:吸取磺基丙氨酸一蛋氨酸礬標(biāo)準(zhǔn)貯備液((4.7)和氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液

(4.8)各1.00mL,置于50mL容量瓶中，加稀釋上機(jī)用檸檬酸鈉緩沖液((4.4)定容，混勻。有關(guān)各組份

濃度為50nmol/mL.

5儀器、設(shè)備

5.1實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī);

5.2樣品篩:孔徑0.45mm(40目);

5.3分析夭平:感量0.0001g;

5.4噴燈;

5.5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或濃縮器:可在室溫至65℃間調(diào)溫，控溫精度士1'C,真空度可低至3.3X10'Pa

(25mmHg柱)

5.6恒溫箱或水解爐;

5.7氨基酸自動分析儀:要求蛋氨酸A的分辨率大于900X0

6樣品

取具代表性的飼料樣品，用四分法縮減分取25g左右，粉碎并過0.45mm孔徑(40目)篩，充分混

勻后裝入磨口瓶中備用。

7分析步駐

7.1氧化和水解:稱取含蛋白質(zhì)7.5-25mg的試樣雙份(精確至0.0001g，樣品量不超過75mg),置

于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器20mL濃縮瓶或濃縮管中，于冰水浴中冷卻30min后加入已經(jīng)冷卻的過甲酸溶液((4.2)

2mL，加液時需將樣品全部潤濕，但不要搖動，蓋好瓶塞，連同冰浴一道置于00C冰箱中，反應(yīng)16h

以下步驟依使用不同的氧化終止劑而不同:

若以氫澳酸為終止劑，于各管中加入氫澳酸((4.1)0.3mL，振搖，放回冰浴，靜置30min，然后移到

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或濃縮器(5.5)上，在60'C、低于3.3X10'Pa(25mmHg柱)下濃縮至干。用鹽酸溶液

(4.3.1)約15mL將殘?jiān)哭D(zhuǎn)移到20mL安瓶中，封口，置恒溫箱中、11。士1C下水解22^24h也可

用6.0mol/I鹽酸溶液約25ml將殘?jiān)D(zhuǎn)移到50mL消煮管中，于水解爐中、11。士3℃下回流水解

22-24h.

取出安瓶或水解管，冷卻，用水將內(nèi)容物定量地轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，定容。充分混勻，過濾，取1

-2mL濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或濃縮器中，在低于50℃的條件下，減壓蒸發(fā)至千。加少許水重復(fù)蒸干2-

3次準(zhǔn)確加入一定體積((2^-5mL)的稀釋上機(jī)用檸檬酸鈉緩沖液(4.5)振搖，充分溶解后離心，取上清

GB/T15399一94

液供儀器測定用

若以偏重亞硫酸鈉為終止劑，則于樣品氧化液中加入偏重亞硫酸鈉溶液(4.2.2)0.5ml，充分搖勻

后，直接加人鹽酸溶液((4.3.2)17.5mL,置110士3C水解22^-24h.

取出水解管，冷卻，用水將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液(4.4)中和至pH約2.2,

并用稀釋上機(jī)用緩沖液(4.5)定容，離心，取上清液供儀器測定用。

如氨基酸分析受上機(jī)樣品液中Na十濃度影響，色譜峰出峰時間漂移過大，則需先將水解液定容過

濾，而后取2^-5mL濾液，于50℃下，減壓蒸發(fā)至約。.5mL(切勿蒸干)，用稀釋上機(jī)用緩沖液((4.5)將

其轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加氫氧化鈉溶液(4.4)調(diào)至pH2.2，并用稀釋上機(jī)用緩沖液((4.5)定容?；?/p>

勻，離心，取上清液供儀器測定用。

濃縮料測定首先按GB6439測定其NaCl含量。樣品處理步驟同上，只是氧化劑使用4.1.2.

7.2測定:用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液(4.9)，按儀器說明書，調(diào)整儀器的操作參數(shù)和(或)洗脫用檸檬酸

緩沖液((4.5)的pH，使蛋氨酸礬分辨率達(dá)最佳狀態(tài)(大于或等于9000)，注入制備好的樣品和氨基酸標(biāo)

準(zhǔn)工作液((4.9)，進(jìn)行分析測定。每5個樣品(即10個單樣)為一組，組間插入混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液

(4.9)進(jìn)行校準(zhǔn)。

8分析結(jié)果的表述

分析結(jié)果表示為膚氨酸和蛋氨酸在樣品中的質(zhì)量百分率，計(jì)算公式如下

沐

A-m

朧(蛋)氨酸(%)=to-sxDxloo······················??(2)

式中:A-—每毫升上機(jī)樣品液中朧(蛋)氨酸的含量,ng;

m—樣品質(zhì)量,mg;

D—樣品稀釋倍數(shù)。

以兩個平行樣品測定結(jié)果的算術(shù)平均值報告結(jié)果，保留兩位小數(shù)。

9重復(fù)性

兩個平行樣品測定值