1、電泳儀器操作,主要內(nèi)容,電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)和微波爐的作用，工作原理，操作關鍵技術，以及注意事項。,電泳原理,電泳的定義：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動的現(xiàn)象。 電泳的基本原理：不同的物質(zhì)在一定的電場強度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動速度不同進而達到分離目的。 電泳技術：利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術稱為電泳技術。 電泳的作用：主要用于蛋白質(zhì)、核酸、同工酶、氨基酸、多肽等物質(zhì)的分離；還可用于對分離物質(zhì)的純度和分子量的測定。,電泳的分類,根據(jù)電泳分子的大小分為： 凝膠電泳：主要用于小蛋白質(zhì)分子和核酸分子的分離 毛細管電泳

2、：主要用于糖類和大蛋白分子的分離 根據(jù)電泳方法，大致可分為3類： 顯微電泳 自由界面電泳 區(qū)帶電泳：應用最廣泛,電泳的分類,區(qū)帶電泳按支持物的物理性狀不同，可分為： (1）紙電泳：支持物為濾紙; (2）粉末電泳：如纖維素粉，淀粉，玻璃粉電泳； (3）凝膠電泳：如瓊脂，瓊脂糖，硅膠，淀粉膠，聚丙烯酰胺凝膠電泳； (4）緣線電泳：如尼龍絲，人造絲電泳 區(qū)帶按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可分為： (1）水平板電泳：支持物水平放置，是最常用的電泳方式； (2）垂直板電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳。 (3）柱狀（管狀）電泳：聚丙烯酰胺凝膠可灌入適當?shù)碾娪竟苤凶龀晒軤铍娪尽?電泳的分類,根據(jù)蛋白

3、質(zhì)分離的目的分為： 單向電泳：只在聚丙烯酰胺凝膠上分離。適于分離種類較少的蛋白。 雙向電泳：第一向使用預制膠條進行蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，第二向?qū)⒛z條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚丙烯酰胺凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小與第一向相垂直分離。用于蛋白質(zhì)的分離，可將提取的蛋白質(zhì)混合物中數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離開。,單向與雙向電泳條帶比較,單向電泳條帶,雙向電泳條帶,電泳實驗過程,水平板電泳： 制膠插試樣格（梳子）取試樣格點樣電泳染色凝膠成像（對電泳結(jié)果進行觀察記錄和分析）。 垂直板電泳： 連續(xù)電泳：直接灌分離膠 配制凝膠溶液灌膠 不連續(xù)電泳：灌分離膠濃縮膠 插試樣格取試樣格點樣電泳染色脫色成像觀察和記錄

4、。,儀器一、電泳儀,作用：在電泳中提供電壓與電流。 1、電泳儀的分類 根據(jù)電泳儀的電壓范圍可將電泳儀分為3類： （1）常壓電泳儀（600V）：用于凈電荷和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳； （2）高壓電泳儀（3000V）：用于載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳和DNA測序； （3）超高壓電泳儀（30005000V）：用于毛細管電泳。 根據(jù)控制程序分為： 單恒（恒壓）、雙恒（恒流和恒壓）、三恒（恒流、恒壓、恒功率）。 (不論是單恒、雙恒、還是三恒，儀器工作時任何情況下只能穩(wěn)U、I、P中的一種參數(shù))。,毛細管電泳儀,超高壓電泳儀 （高效毛細管電泳儀),常壓電泳儀,高壓電泳儀,梯度電泳儀(用于土壤微生物的分離）,

5、生物分析儀（微流控芯片電泳儀）,2、操作方法 這里以我們實驗室常用的北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-12型電腦三恒多用電泳儀為例說明。 U、I、P的有效輸入范圍： U：4-1000v（常壓電泳儀） I： 4-500mA P：4-300w 可以同時連接4組電泳槽（并聯(lián)），此時應選擇穩(wěn)壓輸出，當接多個電泳槽時，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和。,電極插座,（1） 設置工作程序 方法有三種： 用鍵盤輸入新的工作程序，主要使用該方法（見后邊介紹）。 按讀取 鍵，取出保存在0中的上次工作程序，然后按確認鍵。（該電泳儀默認保存上次程序） 按讀取、 0-9、確定鍵，取出保存在(0-9)中的工作程序。取出保存的

6、程序，必須檢查一遍，確認無誤后才可啟動儀器工作。,（2）按鍵操作,A、模式鍵用于選擇設置工作模式。 每按一下模式鍵，其工作方式按下列順序改變： STD（標準） TIME(定時) VH(伏時) STEP(分步) 標準模式到時不關輸出，只是蜂鳴提示，需人工關機； 定時模式到時關輸出； 伏時模式輸出電壓與工作時間的乘積達到設定值時關輸出； 分步模式輸出按步（-）及模式（定時或伏時）分別設定及執(zhí)行。 通常使用標準模式和定時模式。 B、選擇鍵用于選擇設置U、I、P、T的參數(shù) 設置時先看U是否為反顯狀態(tài)，每按一次移到下一個參數(shù)，移動順序為： U= I= P= T=,C、清除鍵：可以清除有反顯提示的參數(shù)數(shù)值

7、。如果輸入錯誤，可以按清除鍵，再重新輸入。 D、啟動鍵：確認參數(shù)無誤后，啟動電泳儀輸出程序。 E、 +鍵：在輸出情況下遞增反顯U、I、P、T的數(shù)值；每按一次遞增一個數(shù)字，弱按住不放，則連續(xù)快速遞增。 F、-鍵：在輸出情況下遞減反顯U、I、P、T的數(shù)值；每按一次遞減一個數(shù)字，弱按住不放，則連續(xù)快速遞減。 G、繼續(xù)鍵：當電泳過程中出現(xiàn)人為中斷停機，并希望繼續(xù)接著輸出工作，可以按繼續(xù)鍵，此后電泳儀接著前面的工作時間繼續(xù)工作。 工作結(jié)束時，儀器顯示“End”，并連續(xù)蜂鳴提示，此時可按任意鍵止鬧。關掉電源，拔出電源連接線。,（3）電源參數(shù)設定原則,穩(wěn)定電壓時，首先將電壓的準確數(shù)值輸入進去，其它電流或功率

8、值要高于正常工作值，否則電壓不能穩(wěn)恒定。穩(wěn)定電流時，首先將電流的準確數(shù)值輸入進去，其它電壓或功率值要高于正常工作值，否則電流不能恒定。穩(wěn)定功率時，首先將準確的數(shù)字輸進去，其它電壓電流值要高于正常工作值，否則功率不能恒定。 一般預置電壓或電流值要在工作電壓或電流值的基礎上加30，通常1v電壓0.35mA工作電流，1mA3.5V工作電壓，實際工作功率工作電壓工作電流。 例如：恒定電壓為200v，預設電流100mA（工作電流+30mA），通常V電壓0.35mA工作電流，200V電壓預計工作電流為70mA，電流再向上加30mA=100mA。,顯示屏,V： 0 v u=100v Mode: STD I：

9、 0 mA I=50mA W： 0 w p=50w T: 00:00 T=1:00 ,實際工作值,設置參數(shù),3、電泳儀使用注意事項 嚴禁將電泳槽放在電泳儀頂部，避免緩沖液灑進儀器內(nèi)部。 電泳前，禁止將電泳槽附帶的電源導線連接到電泳儀電源上。 勿用有機溶劑清潔面板。 本儀器工作時電壓較高，使用中應避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險。,儀器二、電泳槽,常用電泳槽分為水平板和垂直板兩種。 1、電泳槽的作用 水平板電泳槽主要用于大分子量的核酸和蛋白質(zhì)的鑒定、分離和制備，還可測定核酸的分子量。 垂直板電泳槽主要用于小分子量的核酸和蛋白質(zhì)分離、純化及檢測；還可進行雙向電泳的第二向。 這里我們以常用

10、的水平板電泳槽為例講解使用方法。,水平電泳槽,電泳槽種類,垂直電泳槽,電泳槽種類,電泳槽種類,柱狀電泳槽,2、水平板電泳槽主要結(jié)構(gòu) 主要由裝有鉑絲電極和緩沖液的主槽、凝膠托盤、試樣格（梳子）、擋板與電泳導線組成。 3、水平板電泳槽（DYCP-33A型）使用方法 先把凝膠托盤放在平臺上，把擋板插入槽中。將融化的瓊脂糖溶液冷至 55 ，用少量瓊脂糖凝膠將玻璃板封邊，放置樣品梳。接著將融化的瓊脂糖凝膠溶液不間斷地倒在模子中（厚度依樣品濃度而定，須注意避免氣泡混入） , 室溫下自然凝固。,待凝膠聚合后，輕輕拔掉擋板和梳子。注意先拔一側(cè)，垂直拔出會使膠孔產(chǎn)生真空，導致部分凝膠被帶出。把凝膠托盤移入電泳槽

11、，加入緩沖液，使凝膠全部被浸沒。（注意：加樣孔靠近負極一端） 在梳井內(nèi)加樣，注意避免引入氣泡；槍頭不能插入太深，防止穿透膠塊。 蓋好上蓋，連接電泳儀電源與電泳槽之間的電泳導線。 注意不要接錯正負極，檢查無誤后接通電泳儀電源。根據(jù)凝膠板的薄厚選擇適宜的電壓與電流。,當溴酚藍指示劑前沿到達膠的底部3/4處時停止電泳。電泳實驗結(jié)束先關閉電泳儀電源；隨之拔除電泳導線，然后打開泳槽上蓋，取出凝膠托盤。 將凝膠移至染色區(qū)的通風櫥內(nèi)用EB染色液染色1020分鐘，然后將膠片轉(zhuǎn)移至沖洗盤，沖洗掉多余的EB染色液，再轉(zhuǎn)移到海綿上，進行兩次徹底的吸水，直至膠片上沒有水痕時，用保鮮膜包裹膠片，轉(zhuǎn)移至凝膠成像儀中進行凝

12、膠成像。,4、水平板電泳中常見問題與注意事項 染色必須在電泳結(jié)束后，在染色區(qū)進行，禁止在電泳槽內(nèi)加EB染色液。 分不清正負極，導致樣品跑到緩沖液中。紅色為正級、黑色為負極，樣品從負極跑向正極，加樣孔靠近負極一端。 加樣時槍頭不能插入太深，防止穿透膠塊，剛剛插入即可。 制膠濃度必須根據(jù)marker要求的濃度制備，否則小分子物質(zhì)很容易跑出膠塊。 在沒有經(jīng)驗的情況下，最好設置定時，否則由于疏忽樣品就可能跑出膠外。 緩沖液問題。樣品必須完全溶解于上樣緩沖液中（TE），否則不能在凝膠中移動；制膠和實際電泳采用同種緩沖液（TAE）；緩沖液加到凝膠上之后才能點樣。,垂直電泳整個操作過程 制膠灌膠（不連續(xù)電泳

13、：灌分離膠加蒸餾水灌濃縮膠）插入試樣格加緩沖液（上、下兩部分）拔掉試樣格加樣品蓋上蓋子，接通電泳儀電源染色脫色。,JY-SCZ8型垂直板電泳槽使用方法,1、使用去污劑將凝膠玻璃板反復擦洗曬干，再用無水乙醇擦凈表面。 2、制膠時，首先挑選適合凝膠厚度的電泳玻璃，采取凹形玻璃板（簡稱凹板）在內(nèi)芯內(nèi)側(cè)、矩形玻璃板（簡稱平板）在內(nèi)芯外側(cè)的方向，順著內(nèi)芯一側(cè)的緊固側(cè)板小心放入。 特別注意 如果將凹板和平板的方向裝反（平板在內(nèi)，凹板在外），將無法直接電泳，需要再次移動玻璃。 3、選擇平整操作臺面（建議在玻璃板上操作），當玻璃放入內(nèi)芯后，確認凹、平板的底部邊緣均與臺面對齊，再擰緊緊固旋鈕。 特別注意 使凹板

14、、平板的底部邊緣均與桌子上的玻璃臺面對齊是密封的重要條件。如果是初學者，建議在擰緊緊固旋鈕后將內(nèi)芯翻轉(zhuǎn)過來，便于用眼睛觀察或者用手的觸摸檢查是否平齊。,4、將裝好玻璃板的內(nèi)芯，安裝在制膠底座上，壓緊吊扣。 5、將配制好的分離膠溶液，緩慢向凝膠腔內(nèi)注入，注意不要產(chǎn)生氣泡。 6、分離膠灌完后，用滴管在分離膠表面輕輕注入一層正丁醇溶液或蒸餾水以保證分離膠的無氧聚合。 7、當分離膠聚合后，倒出表面的正丁醇溶液或蒸餾水，并用吸紙吸干。 8、在分離膠表面注入濃縮膠，注入高度距凹板下沿2-3mm或與之平齊。 9、向凝膠內(nèi)插入相應的加樣梳。 特別注意在灌膠時無論是灌分離膠或是濃縮膠，在凝膠沒有聚合時不要移動制

15、膠器，以確保凝膠表面的平整，保證最終的電泳效果。 10、當凝膠聚合后，取出梳子，打開搭鉤，從制膠器中取出內(nèi)芯，放入電泳槽底槽中，制膠過程結(jié)束。,注意事項 1、組裝玻璃板。在組裝玻璃板時，下部的兩個螺栓不要擰得過緊，只要使玻璃板與鋁板充分接觸即可。 2、分離膠濃度的選擇。低濃度膠對大分子量蛋白質(zhì)分離效果好；高濃度膠對小分子量蛋白質(zhì)分離效果好。 3、TEMED的加入量。TEMED是促進聚丙烯酰胺聚合的加速劑。加速效果隨試劑保存時間而變化。對于陳舊試劑，可適當多加。事實上，配制分離膠時每塊膠板按2滴加入，效果也不錯。 4、電極緩沖液的配制。電極緩沖液的用量大、占體積、配制麻煩。如果經(jīng)常跑膠，可考慮配

16、制5X濃度的濃縮液。方法如下：將144g甘氨酸和30.2g Tris溶于1升蒸餾水中。使用時稀釋5倍。 5、丙烯酰胺的毒性。丙烯酰胺和甲叉夾雙丙烯酰胺都是神經(jīng)性毒劑，對皮膚有刺激作用。但在聚合形成凝膠后毒性降低，在膠體沒凝固時不要亂倒膠液，應待凝固后放入垃圾桶。操作時應戴橡膠或塑料手套，盡量避免接觸皮膚，并注意實驗后洗手。 6、保養(yǎng)鋁板。每次使用完后應及時清理、擦拭，尤其是鋁板的表面，為防止長時間污垢堆積不能與玻璃板充分接觸，以降低恒溫效果。 7、本品為易碎品，在搬運過程中應注意輕拿輕放。,附1： DYCZ-24F型電泳槽操作方法,（1）將一片PE軟片（可重復多次使用）平放在制膠架內(nèi)。 （2）

17、將接觸膠面的二塊玻璃板用紗布沾著酒精順著一個方向擦，然后晾干,再將清洗干凈的凝膠玻璃放入制膠架內(nèi)的PE軟片上, 凹槽玻璃沖外。 （3）合上制膠槽面板，用四個轉(zhuǎn)向夾子夾緊固定。,（4）灌分離膠至上沿約23厘米處。 （5）立即加蒸餾水壓上，以隔氧和去氣泡。室溫垂直放置，3060分鐘后分離膠完全聚合，傾出分離膠上的覆蓋層液體，用濾紙條吸干殘留水分。 （6）灌濃縮膠。,（7）立即插入試樣格；待膠凝固后，松開轉(zhuǎn)向夾子，取出玻璃膠室。 （8）裝夾玻璃膠室：在本體兩側(cè)裝入玻璃膠室，注意使兩凹口相對。插入斜插板并夾緊(注意使斜插板的大平面與玻璃接觸)。若只跑一塊膠，將一側(cè)不跑膠的平凹玻璃互換。,（9）先在上槽

18、內(nèi)加入緩沖液，然后再在下槽內(nèi)加入緩沖液,最多可加至上槽黑色密封條處。拔掉試樣格。 （10）加樣品：用微量注射器小心加入，每加完一個樣品應清洗加樣注射器，最后在所有不用的樣品槽中加上等體積的樣品溶解液。 （11）電泳：蓋上上蓋，接通電泳儀電源，選擇適宜的電泳參數(shù)進行電泳。 （12）結(jié)束電泳：待電泳的指示劑跑到槽的底部后,停止電泳。先關閉電泳儀電源，然后拔掉電源導線，松開斜插板，放掉上槽緩沖液，取出玻璃膠室，用很薄的刀片,輕輕的插進凹槽玻璃的頂部與另一塊玻璃之間的縫隙,用薄刀片輕輕向上撬,將上層玻璃輕輕撬開。 （13）染色：將有膠板的玻璃板平放在桌上，用刀片從2側(cè)沿著玻璃條劃開。(或不劃開,帶著玻

19、璃染色,脫色) 將劃開的玻璃反轉(zhuǎn),將膠面朝著染色液,用薄刀片輕輕在膠面頂部劃開一個小口子,用一次性吸管順著劃開的小口不斷滴加染色液,膠自動從玻璃板剝離下來,落進染色液中, 染色1小時。 （14）脫色：將染色后的膠片放到脫色液中脫色, 可用脫色搖床脫色,直至膠片背景蘭色成完全透明狀, 即可看到清晰的分離條帶。,附2： 測序電泳槽,（1）清洗配件及硅化玻璃 清洗：戴手套，清洗所有配件，包括：玻璃板、邊條、梳子。 硅化：先用紗布沾酒精順時針方向擦兩塊玻璃板內(nèi)側(cè)，晾干后，用面巾紙沾親水硅烷順時針擦拭“平板玻璃”，用疏水硅烷順時針擦“凹板玻璃”，晾干備用。,（2）制膠過程 制膠過程需在水平臺上進行。 首

20、先用水平球調(diào)節(jié)水平臺的水平，水平臺的三個支腳螺旋可調(diào)整水平。 將平板玻璃平放于水平臺上，將邊條放于玻璃板兩側(cè)。 注意：邊條應與玻璃底部及側(cè)邊對齊！,（3）安裝膠板 旋鈕旋緊的力度以紅色密封條剛剛變形為準，旋緊的力度要均勻，用力過大或過小都會影響電泳槽正常運行。 （4)加緩沖液 在上、下緩沖液槽中加注電泳緩沖液，液面高度要高過凹形玻璃板凹口底邊5至10毫米。 （5）預電泳 連接電泳儀，恒功率7080W，預電泳30分鐘。,（6）插入鯊魚齒梳 預電泳完成后，用滴灌沖洗上樣孔后，將鯊魚齒梳的尖端小心插入凝膠板。插入的深度以齒尖進入凝膠1mm為宜。 注意：如圖所示：將梳子從凝膠板的一端插入，慢慢向下用力

21、，防止破壞鯊魚齒的尖端。 （7）上樣 預電泳完畢后，斷開電源，從靠里的凹玻璃處加樣，上樣量為68ul。,垂直電泳中常見問題及注意事項 （1）點樣時樣品向上漂，不下沉時，尤其在加尿素（變性劑）的情況下，要用蒸餾水嚴格沖洗點樣孔的雜質(zhì)（未聚合丙烯酰胺），直至點樣孔清晰透亮才可點樣。 （2）染色時，為了防止乙酸揮發(fā)影響呼吸，注意將染色盤用蓋子蓋住。 （3）灌膠前嚴格清洗模具，以免凝膠板和玻璃板之間產(chǎn)生氣泡或滑膠。電泳后取凝膠板時因玻璃板不干凈，凝膠不易從玻璃板上取下，易斷裂。 （4）灌分離膠后立即加蒸餾水覆蓋；灌濃縮膠前，先用濾紙吸去覆蓋水,再灌膠。 （5）未聚合的丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑。但在聚合形成凝

22、膠后毒性降低，在膠體沒凝固時不要亂倒膠液，應待凝固后放入垃圾桶，操作時注意戴手套。,4、電泳槽的清洗與維護 使用時注意保持電泳槽的清潔；使用后要徹底清洗，可用海綿沾少許洗衣粉、洗滌劑清洗，再用無離子水沖洗干凈，放在無灰塵處晾干備用。,儀器三、凝膠成像系統(tǒng),1、什么是凝膠成像系統(tǒng)？ 凝膠成像系統(tǒng)是一個集觀察，拍攝和分析凝膠于一體的凝膠分析系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)可以對凝膠進行定量和定性分析。（電泳結(jié)果的定性和定量分析） 2、用途 用于核酸、蛋白質(zhì)電泳的觀察、照像和實驗結(jié)果的科學分析。,3、結(jié)構(gòu) 由CCD檢測器、暗箱、紫外透射臺、紫外和白光光源、圖像采集軟件、圖像分析軟件組成。,4、凝膠成像系統(tǒng)分析樣品的

23、工作原理 凝膠成像系統(tǒng)可以對樣品進行定量和定性的分析。 定性的原理：由于樣品在電泳凝膠或者其他載體上的遷移率不一樣，將未知樣品在圖譜中的位置與標準品在圖譜中的位置相比較，可以確定位置樣品的成份和性質(zhì)，做定性分析。 定量的原理：光源發(fā)出的光照射到樣品，不同的樣品對光吸收的量有差異，從而照相所得的圖像上面的樣品條帶的光密度也會有差異。光密度與樣品的濃度或者質(zhì)量成線性關系。將未知樣品的光密度與已知濃度的樣品條帶的光密度進行比較，可以得到未知樣品的濃度或者質(zhì)量，做定量分析。,5、操作方法 （1）打開紫外箱（暗箱）電源開關，該開關在暗 箱右后部。 （2）啟動電腦，啟動成像應用程序Genesnap。 （3

24、）上拉暗箱門，紫外成像時在藍色玻璃板上放入染色后的凝膠。 （4）關上暗箱門。,點擊,點擊應用程序,啟動應用程 序后的屏幕,（5）從左側(cè)選擇光源，紫外成像用紫外透射儀(transluminator)，白光成像使用上部光源(upper)或底部光源(lower)。 （7）再次點擊成像。,點擊成像,（6）點擊左側(cè)上部顯示圖像，可按“-”、“+”依次調(diào)節(jié)光圈、圖像縮放大小、調(diào)節(jié)焦距。,光圈,圖像縮放,焦距,（8）點擊菜單欄“文件”（file），選擇“輸出圖像”（export image），選擇圖像類型為bmp或jpg文件格式，輸入文件名，點擊存儲（save）。 （9）關閉退出應用程序。 （10）取出凝膠，EB污染膠放置于指定地點，普通膠放