1、分子生物學(xué)討論課匯報(bào)展示,1,2,3,4,5,6,7,8,目錄,人類基因組DNA提取 限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,匯報(bào)人：,哺乳動(dòng)物的一切有核細(xì)胞都可以用來制備DNA， 除特殊要求外，白細(xì)胞、肝或脾組織是最常用的 材料。原始材料較少或較難獲得時(shí)（如羊水細(xì) 胞），還必須經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)來獲得足夠量的細(xì) 胞；有時(shí)為了簡便易行起見，還可以無創(chuàng)傷地采 集材料，如用口腔上皮脫落細(xì)胞、發(fā)根細(xì)胞。產(chǎn) 前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細(xì)胞或者絨毛 膜細(xì)胞 SDS是一種去污劑，破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì) 膜； 蛋白酶K是一種很強(qiáng)的蛋白水解酶，能消化各種蛋白質(zhì)（包括糖蛋白和肽類）及脂類 和胺類物質(zhì)，但糖蛋白的降解物常與DN

2、A 一同沉淀下來，干擾酶的活性，消化后需 要用酚、氯仿抽提純化；,人類基因組DNA提取,酚能變性蛋白質(zhì)而且還能將變性的蛋白質(zhì)溶解在 其中； （加入1/3體積的飽和NaCl溶液，也可較好地祛除細(xì) 胞降解物而純化DNA，可以避免酚的污染。） 氯仿也是一種有效的蛋白變性劑，它還能促進(jìn)兩 相的分離； DNA上清溶液再經(jīng)氯仿抽提后用乙醇沉淀，分離 純化的DNA。,人類基因組DNA提取,人類基因組DNA提取,從全血中提取,1,2,從口腔上皮脫落細(xì)胞，發(fā)根細(xì)胞中提取,人類基因組DNA提取,人類基因組DNA提取,人類基因組DNA提取,無水乙醇沉淀時(shí)可見白色絮狀物 0.8%瓊脂糖凝聚電泳可見一基因組DNA條帶

3、OD值測定,人類基因組DNA提取,飽和酚吸取時(shí)記得吸取下層的有機(jī)相 乙醇沉淀時(shí)，要沿離心管壁向DNA溶液中加入無水乙醇，輕輕搖動(dòng)離心管混合至體系完全均一，見白色絮狀DNA 收集細(xì)胞的多少是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵 沉淀中加入1mlSTE后，打散細(xì)胞團(tuán)便于充分消化細(xì)胞,人類基因組DNA提取,限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位 的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵 進(jìn)行切割的一類酶，簡稱限制酶。,限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,類和類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處

4、的DNA，而類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子，然后從底物上解離。 類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)類限制酶識(shí)別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列（如EcoR識(shí)別六個(gè)核苷酸序列：5- GAATTC-3），有少數(shù)酶識(shí)別更長的序列或簡并序列。類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段（如Sma：5-CCCGGG-3）；有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端。,限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,瓊脂糖凝膠電泳 結(jié)果分析 應(yīng)用,匯報(bào)人：,1、分析條帶出現(xiàn)拖尾 原

5、因：蛋白質(zhì)沒有去除干凈 2、最下端出現(xiàn)明亮的條帶 原因：樣本中含有RNA,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,3、條帶的粗細(xì) 原因：表明提取出的DNA的多少 4、條帶沒有出現(xiàn) 原因：1）膠太濃了，DNA跑不進(jìn)來 2） 最后洗膠的時(shí)候沖跑了,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,應(yīng) 用,人類基因組研究的一個(gè)關(guān)鍵應(yīng)用是通過位置克隆尋找未知生物化學(xué)功能的疾病基因。這個(gè)方法包括通過患病家族連鎖分析來繪制包含這些基因的染色體區(qū)域圖，然后檢查該區(qū)域來尋找基因。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,基因組序列的可用性同樣允許疾病基因的旁系同源性的快速識(shí)別，對于兩個(gè)理由是有價(jià)值的。首先，旁系同源基因的突變可以引起相關(guān)遺傳疾病。

6、通過基因組序列使用發(fā)現(xiàn)的一個(gè)很好的例子是色盲（完全色盲）。CNGA3基因，編碼視錐體光感受器環(huán)GMP門控通道的a亞單位，顯示在一些色盲家系中存在突變體?；蚪M序列的計(jì)算機(jī)檢索揭示了旁系同源基因編碼相應(yīng)的b亞單位，CNGB3（在EST數(shù)據(jù)庫中沒有出現(xiàn)）。CNGB3基因被快速認(rèn)定為是其他家系的色盲的原因。另一個(gè)例子是由早衰1和早衰2基因提供的，它們的突變可能導(dǎo)致Alzheimer疾病的的早期發(fā)生。第二個(gè)理由是旁系同源體可以提供治療敢于的機(jī)會(huì)，例子是在鐮刀狀細(xì)胞疾病或地中海貧血的個(gè)體中試圖再次激活胚胎表達(dá)的血紅蛋白基因，它是由于-球蛋白基因突變引起的。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,在過去的世紀(jì)里，制藥產(chǎn)業(yè)

7、很大程度上依賴于有限的藥物靶來開發(fā)新的治療手段。最近的綱要列舉了483個(gè)藥物靶被看作是解決了市場上的所有藥物。知道了人類的全部基因和蛋白質(zhì)將極大的擴(kuò)展合適藥物靶的尋找。雖然，僅僅人類的小部分基因可以作為藥物靶，可以預(yù)測這個(gè)數(shù)目將在幾千之上，這個(gè)前景將導(dǎo)致基因組研究在藥物研究和開發(fā)中的大規(guī)模開展。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,半胱氨酰基白三烯的收縮和炎癥作用，先前認(rèn)為是過敏反應(yīng)的慢反映物質(zhì)（SRS-A），通過特定的受體介導(dǎo)。第二個(gè)類似的受體，CysLT2，使用老鼠EST和人類基因組序列的重組得到識(shí)別。這導(dǎo)致了與先前識(shí)別的唯一的其它受體有38%氨基酸一致性的基因的克隆。這個(gè)新的受體，顯示高的親和力和幾個(gè)

8、白三烯的結(jié)合，映射在與過敏性哮喘有關(guān)的第13號(hào)染色體區(qū)域上。這個(gè)基因在氣道平滑肌和心臟中表達(dá)。作為白三烯途徑中抗哮喘藥物開發(fā)中一個(gè)重要的靶，新受體的發(fā)現(xiàn)有明顯的重要的作用,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,人體基因組圖譜是全人類的財(cái)產(chǎn)，這一研究成果理應(yīng)為全人類所分享、造福全人類，這是參與人類基因組工程計(jì)劃的各國科學(xué)家的共識(shí)。值得關(guān)注的是，目前在人類基因組研究領(lǐng)域，出現(xiàn)了一些私營公司爭相為其成果申請專利的現(xiàn)象。美國塞萊拉基因公司曾表示，想把一部分研究成果申請專利，有償提供給制藥公司。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,找到了一批主宰人體疾病的重要基因如：肥胖基因、支氣管哮喘基因。這類基因的新發(fā)現(xiàn)每年都有新報(bào)道。這些基因

9、的發(fā)現(xiàn)，增進(jìn)了人們對許多重要疾病機(jī)理的理解，并且推動(dòng)整個(gè)醫(yī)學(xué)思想更快的從重治療轉(zhuǎn)向重預(yù)防。例如：湖南醫(yī)科大學(xué)夏家輝教授組于1998.5.28發(fā)表克隆了人類神經(jīng)性高頻性耳聾的致病基因（GJB3），這是第一次在中國克隆的基因。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取 RT-PCR的原理、方法,匯報(bào)人：,人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取,真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中總RNA主要由rRNA、 tRNA和核內(nèi)小分子RNA、mRNA 組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。,人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取,破碎組織 分離RNA 沉淀RNA洗滌RNA 融解RNA保存RNA,破碎：可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋

10、白 酶K等破碎組織 加入 -ME可以抑制RNA酶活性 分離：一半用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊 醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層， 與蛋白層分開。一半用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊 醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層， 與蛋白層分開。 沉淀：一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。 洗滌：使用70乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉， 此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干 乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。 溶解：一般使用TE。 保存：應(yīng)該盡量低溫,人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取,分析不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)狀況 獲得新基因 研究基因的拼接 分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物,人類細(xì)

11、胞質(zhì)RNA提取,即逆轉(zhuǎn)錄PCR，提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。,RT-PCR的原理、方法,RT-PCR的原理、方法,提取總 RNA,合成 cDNA,PCR,RT-PCR的原理、方法,RT-PCR的原理、方法,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (RT),RT-PCR的原理、方法,PCR,瓊脂糖凝膠電泳 結(jié)果分析 應(yīng)用,匯報(bào)人：,哺瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:它兼有分子篩和電泳的雙重作用。,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,數(shù)量,質(zhì)量,條帶的寬度 熒光的亮度,純 度 分子量,結(jié)果初步分析,人類基因組