1、2020/7/29，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，1。實驗2:蛋白質(zhì)的性質(zhì)(1)蛋白質(zhì)和氨基酸的顯色反應(yīng)，2 .2020年7月，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，本實驗旨在了解蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元和主要連接方式，以及蛋白質(zhì)和一些氨基酸的顯色反應(yīng)原理。學(xué)習(xí)幾種常用的識別蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。2020/7/29/3，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，方法微量定量測定蛋白質(zhì)：凱氏定氮法，縮二脲法，茚三酮法，福林酚法，考馬斯亮藍(lán)G250法，2020/7/29/4，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，實驗原理，尿素雙脲紫絡(luò)合物在堿性溶液中，蛋白質(zhì)和Cu2形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色與蛋白質(zhì)濃度成正比，但與蛋白質(zhì)濃度無關(guān)在

2、某些條件下，未知樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時反應(yīng)，并在540-560納米處比較顏色。未知蛋白質(zhì)濃度可通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液可用結(jié)晶牛(或人)血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末制備。實驗原理，2020/7/29/6，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，實驗原理，在弱酸(pH5-7)條件下，蛋白質(zhì)或氨基酸可與茚三酮加熱形成藍(lán)紫色縮合物。這種反應(yīng)是所有蛋白質(zhì)和氨基酸共有的(亞氨基酸如脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色化合物)。其他含氨基的化合物也能發(fā)生這種反應(yīng)。2020/7/29/7，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，實驗原理，黃色反應(yīng)蛋白溶液在遇到硝酸時首先產(chǎn)生白色沉淀，然后白色沉淀在加熱后變成黃

3、色，然后加入堿后顏色加深為橙黃色。這是因為硝酸在蛋白質(zhì)分子中硝酸鹽苯環(huán)生成黃色硝基苯衍生物(硝基醌鈉)。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有芳香氨基酸，所以它們都有黃色反應(yīng)。硝基酚(黃色)鄰硝基醌鈉(橙色)，2020/7/29，8，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，實驗原理，考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)，考馬斯亮藍(lán)G250在酸性溶液中以游離形式(棕紅色)存在，通過疏水力與蛋白質(zhì)結(jié)合時變成藍(lán)色。其染色靈敏度比氨基黑高3倍，反應(yīng)速度也快(2分鐘內(nèi)可達到平衡點)。在0.011.0毫克鐠的范圍內(nèi)，鐠與A595納米成正比。2020/7/29/9，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，實驗儀器和試劑，考馬斯亮藍(lán)G250 0.5%苯酚濃硝酸0.1%茚三

4、酮尿素1%硫酸銅2%卵清蛋白溶液，2020/7/29/10，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，實驗程序，縮二脲試驗取少量尿素在干熱下結(jié)晶，用文火熔化尿素，并在再次開始硬化時停止加熱。氨氣釋放并冷卻后，加入約1毫升10%氫氧化鈉溶液，搖勻，加入1滴1%硫酸銅溶液，搖勻，觀察顏色變化，取1毫升卵清蛋白溶液，加入約2毫升10%氫氧化鈉溶液于干燥試管中。搖勻，加入2滴1%硫酸銅溶液，觀察搖勻后的顏色變化。在茚三酮反應(yīng)中取兩根試管，加入1毫升2%卵清蛋白溶液和0.5%甘氨酸溶液，分別加入0.5毫升0.1%茚三酮溶液。混合均勻，在沸水浴中加熱12分鐘，觀察顏色變化。將一滴0.5%甘氨酸溶液滴在一小片濾紙上，在適當(dāng)位置風(fēng)干，然后滴一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液。用文火干燥濾紙觀察顏色變化，2020年7月29日，2020年11月29日，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室，黃色反應(yīng)，2020年7月29日，2020年12月，西南大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實驗室