1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),一株產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的選育研究,山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 微生物學(xué)系 2012.8,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,一、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的篩選 二、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的誘變育種 三、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的分類鑒定 四、產(chǎn)酶菌株生長曲線的測(cè)定 五、菌種保藏技術(shù),實(shí)驗(yàn)要求,一、每個(gè)實(shí)驗(yàn)相對(duì)獨(dú)立，都要提交實(shí)驗(yàn) 報(bào)告； 二、課程中間進(jìn)行三次測(cè)驗(yàn)考核，不再 進(jìn)行期末考試； 三、每8人一組，獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)。,實(shí)驗(yàn)一 產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的篩選,一、目的意義 二、材料方法 三、數(shù)據(jù)結(jié)果 四、討論分析 五、參考文獻(xiàn),一、目的意義,1、篩選獲得一株高產(chǎn)中性蛋白酶的芽孢細(xì)菌菌株。 2、學(xué)習(xí)掌握從樣品采集到菌種

2、保藏的技術(shù)流程。,關(guān)鍵技術(shù):,綜合實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 樣品采集 酪蛋白平板水解圈法初篩 無菌操作,二、材料方法,技術(shù)路線,樣品采集：選用豆豉等富含蛋白質(zhì)的自然樣品進(jìn)行篩選。 富集培養(yǎng)：以酪蛋白為唯一碳源富集培養(yǎng)目標(biāo)菌株。 預(yù)處理：80水浴10分鐘 初篩：水解圈法 復(fù)篩：分光光度計(jì)法,第一次實(shí)驗(yàn)：,討論并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案； 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：培養(yǎng)基、無菌水等； 樣品預(yù)處理（5g豆豉，加入45ml無菌水，80水浴10分鐘處理） 系列稀釋涂平板； 37倒置培養(yǎng)48h；,酪蛋白篩選固體培養(yǎng)基 酪蛋白：5.0g； 酵母膏：2.0 g； 瓊 脂：20.0g； 蒸餾水：1000ml pH: 7.0。,第二次實(shí)驗(yàn)

3、：,從第一次實(shí)驗(yàn)的平板上，觀察選擇產(chǎn)生水解圈的菌落，制片鏡檢觀察； 選擇水解圈最大的、產(chǎn)芽孢的菌落進(jìn)行下一步操作； 將水解圈最大的芽孢細(xì)菌菌落作為目標(biāo)物，在LB平板上進(jìn)行劃線分離； 37倒置培養(yǎng)24h；,LB分離純化固體培養(yǎng)基 蛋白胨：10.0g； 酵母膏： 5.0 g； 氯化鈉：10.0g； 瓊 脂：20.0g； 蒸餾水：1000ml pH到 7.0。,第三次實(shí)驗(yàn)：,挑取生長飽滿的單菌落轉(zhuǎn)接入LB試管斜面，每個(gè)分離物轉(zhuǎn)接5支試管。 37培養(yǎng)24h，保藏備用； 討論下一步實(shí)驗(yàn)方案（紫外線誘變育種）并準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料；,LB斜面保藏固體培養(yǎng)基（同純化培養(yǎng)基） 蛋白胨：10.0g； 酵母膏： 5.0

4、g； 氯化鈉：10.0g； 瓊 脂：20.0g； 蒸餾水：1000ml pH到 7.0。,三、數(shù)據(jù)結(jié)果,初篩依據(jù)： 水解圈直徑（D2）：菌落直徑（D1） D2/D1 = ？ 復(fù)篩依據(jù) Folin -酚法 測(cè)定中性蛋白酶活性,四、討論分析,樣品采集 預(yù)處理 富集培養(yǎng) 初篩 復(fù)篩 評(píng)價(jià)體系 ,五、參考文獻(xiàn)（舉例）,1 孫妍等，產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶納豆芽孢桿菌益生菌株的 篩選及其生長特性研究，東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 學(xué)報(bào)，第42卷 第3期，42（3）：3942。 2 蔡婉玲等，蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選和紫外誘變育種，生物 技術(shù)，2011年21（1）。 3 宋園亮等，元陽豆豉中高產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選及其產(chǎn) 酶條件的研究，中國微生態(tài)學(xué)雜志，2011年1