1、第五章 病毒基因組的復制,病毒的復制方式及概念,特殊的繁殖方式：不是以二分裂而是以復制的方式進行繁殖。 復制（replication）：病毒感染敏感的宿主細胞后，病毒核酸進入細胞，一方面通過自我復制產生子代病毒核酸，另一方面進行表達，合成新的病毒蛋白質，然后由這些新合成的病毒組分裝配成子代病毒體，并通過一定的方式釋放到細胞外，病毒的這種特殊繁殖方式稱為復制。,復制的意義,病毒的基因組攜帶有病毒的全部遺傳信息，其基因組通過復制可以產生許多完全相同子代病毒基因組，并且能夠準確無誤地分配到子代病毒粒子中 。 意義:正是由于病毒核酸的這種自我復制能力，才保證了病毒的遺傳信息相對穩(wěn)定地逐代傳遞下去。,病

2、毒基因組的復制具有一個共同的特點：不論哪一種復制方式都遵循原核和真核生物DNA復制時的堿基互補原則，因此只要知道病毒基因組一條鏈的堿基順序，就可以合成與之相對應的互補鏈。,特點,第一節(jié) 病毒基因組復制的基本特點,大多數(shù)dsDNA病毒的基因組復制與原核生物和真核生物的DNA復制一樣，一般為半保留復制，如T4、T7、噬菌體、SV40、皰疹病毒等的基因組復制，但是呼腸孤病毒的dsRNA基因組則進行的是全保留復制或保留復制。,一、全保留復制和半保留復制,全保留復制:在復制過程中，病毒雙鏈RNA中的兩條RNA親本鏈一直是纏繞在一起的，僅在復制點處有幾個堿基對解鏈，并且在復制酶的作用下復制出一條子代RNA

3、鏈，然后以這條新生鏈為模板合成互補鏈，由此產生子代dsRNA基因組 。,除了呼腸孤病毒的dsRNA基因組進行這樣的復制外，一些由+ssRNA噬菌體基因組復制產生的復制中間體也能通過全保留復制形成子代+ssRNA基因組。,半保留復制:在復制過程中，病毒基因組的DNA雙鏈解鏈成為兩條單鏈，并分別以每條單鏈為模板，按照堿基配對互補的原則，合成出與之互補的新鏈，結果產生由一條新生鏈和一條親鏈構成的子代病毒雙鏈DNA。dsDNA病毒一般以半保留復制的方式進行復制。,二、病毒基因組的復制起始,大多數(shù)DNA病毒基因組的復制都是從一個復制起點即復制原點開始的。一般原核生物基因組的第一輪復制尚未完成之前，可以再

4、從復制原點開始下一輪復制。,真核生物的基因組DNA上有許多復制原點同時起始復制，其復制叉的移動速度比原核生物慢，并且真核生物在第一輪復制和細胞分裂未完成之前，第二輪復制是不可能開始的。,DNA病毒基因組一般只有一個復制原點，其基因組DNA為單復制子，但單純皰疹病毒（HSV）基因組DNA上有3個復制原點，分別稱為oriL、oriS1和oriS2。,在DNA病毒基因組的復制原點區(qū)，通常含有反向重復序列，這種反向重復序列可以形成發(fā)夾結構，其發(fā)夾結構可能與病毒基因組的復制起始和調控有關。,如在噬菌體G4基因組的單鏈環(huán)狀DNA進行復制時，幾乎所有的單鏈部分都與單鏈DNA結合蛋白（SSB）結合，唯有發(fā)夾結

5、構區(qū)是裸露的，這個區(qū)域就成為引發(fā)酶催化RNA引物合成的模板，隨后宿主大腸桿菌DNA聚合酶III以這一RNA為引物，開始延伸合成DNA。,M13噬菌體DNA的復制原點也有發(fā)夾結構形成區(qū)，只是RNA引物的合成是由大腸桿菌RNA聚合酶（2、 、）催化的，而并非由引發(fā)酶催化合成。,脊髓灰質炎病毒含有正鏈RNA基因組，其5 端沒有類似真核生物mRNA5 端的帽子結構，但5端有共價結合的VPg蛋白，其VPg-pUpU可能也是RNA基因組復制起始所必需的引物。,細小病毒由于ssDNA基因組的兩端有末端重復序列形成的反轉發(fā)夾結構，其反轉發(fā)夾環(huán)可作為引物起始DNA的合成，因而不需要RNA引物的存在。,三、病毒基

6、因組的復制方向,dsDNA病毒基因組的復制， 從復制原點開始，可以進行單向或雙向復制，并由子代互補鏈的延伸形成復制叉。,單向復制時，只有一個復制叉；雙向復制時則有兩個復制叉，大部分dsDNA病毒基因組的復制是雙向的。在這種情況下，雙鏈DNA就會出現(xiàn)一個復制泡，在同一個復制泡上的兩個復制叉是否為等速復制尚無定論。,也有一些dsDNA病毒如噬菌體P2、29、腺病毒基因組DNA以及X174的RF DNA的復制是單向的；還有的病毒基因組DNA既可以進行雙向復制，也可以進行單向復制，如噬菌體早期采取式雙向復制，晚期則進行滾式單向復制。,四、連續(xù)復制與不連續(xù)復制,大多數(shù)dsDNA病毒基因組以35方向的DN

7、A鏈為模板，產生先導鏈，而以5 3方向的DNA鏈為模板，進行不連續(xù)復制，生成后隨鏈。,dsDNA病毒的后隨鏈是通過不連續(xù)復制產生的短片段連擋而成的，在真核生物基因組中，這種DNA短片段長度大約為100個核苷酸；,在原核生物基因組中，這種短片段長度則約有1000-2000個核苷酸，即所謂的岡崎片段，在復制過程中，這些片段由DNA連接酶連接起來，形成完整的子代DNA鏈。,不管是先導鏈延伸，還是岡崎片段的合成都需要引物，這些引物是一些更小的RNA或DNA片段。如果引物是RNA的話，那么它們在DNA復制結束后最終是要被切除的，留下的缺口再由DNA聚合酶填上，并經過DNA聚合酶連接起來。,對于含有RNA

8、基因組的病毒來說，比如TMV、呼腸孤病毒、布尼亞病毒、正粘病毒和副粘病毒等，它們的復制常常是連續(xù)合成，即連續(xù)復制，其轉錄/復制酶很少催化不連續(xù)復制。,第二節(jié)病毒基因組復制所需的復制酶,一些DNA病毒如皰疹病毒、痘病毒、T4噬菌體等可編碼合成自身基因組復制所需要的DNA聚合酶，但有的DNA病毒如SV40、多瘤病毒、細小病毒、X174、M13、G4、噬菌體則依賴于宿主細胞的DNA聚合酶。,一般而言，原核和真核生物以及DNA病毒的DNA 復制酶和轉錄酶系統(tǒng)在功能上是完全分開的，其中DNA聚合酶只起復制作用，以產生子代雙鏈DNA分子，而RNA聚合酶只起轉錄作用，以產生RNA，并以mRNA作為模板翻譯合

9、成蛋白質。,但對于RNA病毒來說，病毒編碼的一種RNA依賴性RNA聚合酶，即可以是轉錄酶，也可以是復制酶，所以這種酶常被稱為轉錄/復制酶。,還有的RNA病毒如逆轉錄病毒可以編碼合成逆轉錄酶/RNase H，由它催化病毒基因組RNA逆轉錄合成原病毒DNA；DNA病毒如嗜肝DNA病毒、花椰菜花葉病毒編碼合成的DNA聚合酶，也具有逆轉錄酶/ RNase H活性，能夠催化全長的前基因組RNA逆轉錄生成負鏈DNA，再復制 形成子代雙鏈DNA分子。,除了復制酶以外，DNA病毒的基因組復制還需要病毒或宿主編碼的解旋酶、引發(fā)酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）、拓撲異構酶和DNA連接酶等的參與。,有些DNA病毒基

10、因組由于缺乏編碼復制酶的能力，因而其基因組的復制必須完全依賴于宿主細胞的復制酶，如SV40、多瘤病毒、細小病毒的DNA復制是在真核細胞內完成的，其復制過程完全依賴于宿主細胞的DNA聚合酶及其相關的酶蛋白。,一、 依賴于宿主細胞的復制酶,但目前的一些研究發(fā)現(xiàn)，SV40和多瘤病毒的T抗原蛋白具有解旋酶、拓撲異構酶I和ATPase的酶活性，因而T抗原直接參與了病毒基因組的復制與調控。,許多病毒粒子攜帶有自身編碼的復制酶，或在病毒感染循環(huán)時由病毒基因表達合成的復制酶。DNA病毒來說，病毒復制酶只涉及到DNA復制，不參與轉錄；而對于RNA病毒來說，復制與轉錄是同一種酶。,二、 病毒基因組自身編碼的復制酶

11、,1.DNA病毒自身編碼的復制酶及其相關蛋白 一些真核DNA病毒的基因組可編碼DNA復制酶及其相關蛋白，如痘苗病毒的E9L ORF 編碼分子量為110KD的復制酶，此酶為單一多肽，它除了具有聚合活性外，還具有3 端外切酶活性，能進行切口修復。,腺病毒DNA聚合酶是在早期表達的，其基因位于基因組的E2B區(qū)，這一基因區(qū)編碼產生一個140KD的AD DNA聚合酶，其DNA聚合酶既有5-3的聚合活性，也有3 5 的外切功能，后著可對復制過程中產生的堿基錯配進行較正。,嗜肝DNA病毒科的乙型肝炎病毒（HBV）的病毒粒子內攜帶有自身編碼DNA聚合酶和末端DNA結合蛋白（TP）。DNA聚合酶和TP的ORF在

12、HBV基因組的P區(qū)內，此DNA聚合酶為堿性蛋白，富含組氨酸， 具有逆轉錄酶和RNase H的活性。,2RNA病毒自身編碼的復制酶 一些dsRNA病毒和-ssRNA病毒粒子都攜帶有自身基因組編碼合成的轉錄復制酶。 例如呼腸孤病毒dsRNA基因組有10-12個節(jié)段，其病毒粒子攜帶有自身特異性轉錄復制酶。通常病毒基因組進入宿主細胞后隨即利用該轉錄復制酶進行早期轉錄，,流感病毒的基因組為分節(jié)段的-ssRNA，其病毒粒子中含有自身基因組所編碼的轉錄/復制酶。其中甲型流感病毒的RNAl節(jié)段長2341個堿基 編碼PB2蛋白；RNA2節(jié)段長2341個堿基，編碼PB1蛋白；RNA3節(jié)段長2233個堿基編碼PA蛋

13、白。由PA、PBl、PB2共同組成病毒粒子的轉錄復制酶復合體。,RNA噬菌體如B6、B7、fr、f2、MS2、PRl等僅編碼合成病毒復制酶的一部分組分，如MS2在其RNA的3端有一個由1635個核苷酸序列構成的復制酶基因，它編碼一個60kD的蛋白，這一蛋白與宿主細胞的延伸因子EF-TU、EF-TS以及核糖體蛋白即 S1蛋白之間有很強的親合力，,三、病毒蛋白與宿主細胞蛋白構成的 病毒復制酶,由它們共同結合形成的蛋白復合體，具有RNA復制酶的活性，這種復制酶復合體與病毒基因組RNA的3端特異性序列CCCA結合，以病毒親代+ssRNA為模板合成-sSRNA，再合成子代+SSRNA。,第三節(jié) 病毒基因

14、組的復制,一、病毒基因組復制的主要方式 病毒DNA的復制方式有多種變化、但比較常見的有3種形式：復制叉方式(包括環(huán)狀雙鏈DNA的方式)、滾環(huán)方式和鏈置換方式。,1復制叉方式 所謂復制叉是指雙鏈DNA在復制原點解開成單鏈狀態(tài)，并分別以兩條單鏈為模板互補合成新鏈，由此出現(xiàn)叉子狀的生長點，就稱為復制叉。,大多數(shù)線狀雙鏈DNA病毒如T7、T4噬菌體的基因組dsDNA以復制叉方式進行復制，但環(huán)狀雙鏈DNA如SV40、 噬菌體基因組則以 方式進行復制，其復制叉的生長大多是雙向的，也有的是單向的。,2滾環(huán)方式 滾環(huán)方式是環(huán)狀雙鏈DNA單向復制的特殊形式，在復制時，核酸酶切開其中一條鏈，其5端通常連接有特殊的

15、蛋白，而3端則在DNA聚合酶的作用下，以末切斷的條環(huán)狀DNA鏈為模板，不斷地加上新的核苷酸，由于3端不斷延長，而5端則不斷地甩出，就好象中間一個環(huán)在不斷地滾動一樣，故稱為滾環(huán)復制。,3鏈置換方式 DNA噬菌體 29、腺病毒、痘病毒基因組dsDNA以及細小病毒RF DNA是以鏈置換方式進行復制的，在鏈置換方式復制過程中，通常以3 5的DNA鏈作為模板，并且由新合成的生長鏈置換出與模板鏈互補的親鏈，然后新生鏈和模板鏈互補生成子代dsDNA。,除此而外、腺病毒和 29在復制過程中置換出來的親鏈，經過末端反向重復序列互補可以產生鍋柄樣環(huán)形分子，這種鍋柄樣環(huán)形分子在末端重復序列互補處以鏈置換方式起始復制

16、，合成雙鏈DNA。,1.T4噬茵體基因組DNA的復制 T4 DNA復制發(fā)生在早期轉錄之后，其早期基因首先通過即刻早期轉錄和延遲早期轉錄合成mRNAs，再翻譯產生與復制相關的酶和蛋白質，,二dsDNA病毒基因組的復制,這些酶和蛋白質主要包括：基因43的產物(Gp43)為DNA聚合酶、基因32的產物為單鏈DNA結合蛋白(SSB)、基因60的產物為DNA拓撲異構酶、基因30的產物為DNA連接酶。,2.腺病毒基因組DNA的復制 腺病毒基因組為線狀雙鏈DNA，其5端連接有末 端蛋白TP，它與腺病毒DNA的復制起始有關。腺病 毒DNA進入宿主細胞核之后，病毒基因組開始進行 立即早期和早期mRNA轉錄，,在

17、感染后2-3小時，早期mRNA即可出現(xiàn)在細胞質的核糖體上，并被翻譯成數(shù)種早期蛋自，它們包括E2A基因編碼的SSB蛋白、E2B基因編碼的DNA聚合酶和DNA末端結合蛋白(TP)，這些酶和蛋白都是腺病毒DNA復制所必需的。,腺病毒在感染約8小時后開始DNA復制，再經歷大約8小時達到合成的最高峰。其DNA合成是不同步地從線狀DNA的兩個5端開始的，并且向兩個方間延伸直到分子的另端。其起始引物是病毒編碼的末端蛋白(TP)和與之結合的dCM P。,3痘病毒基因組DNA的復制 痘病毒DNA復制的主要特點是：病毒DNA復制完全在宿主細胞質中進行，而細胞質中很少會有的DNA復制所需的酶類，因此痘病毒幾乎編碼合成了自身DNA復制所需要的全部酶類，甚至痘苗病毒粒子還攜帶有自身編碼的RNA聚合酶復合物。,當痘病毒進入宿主細胞并部分脫殼后，即開始早期轉錄，大約有100個基因是在這一 時期轉錄的，約占整個病毒基因組的一半。,三、dsRNA病毒基因組的復制 呼腸孤病毒具有dsRNA基因組，其dsRNA基因組是分節(jié)段的，有I0-12個節(jié)段, 分為L、M、S三個組，呼腸孤病毒粒子攜帶有病毒特異的RNA依賴性RNA聚合酶，即轉錄復制酶，病毒的dsRNA基因組在 轉錄復制酶的催化下以全保留的方式進行復制。,四. +ssRNA病毒基因組的復制 含有+ss