1、臨床病原學(xué)檢查,目的要求,掌握：感染性疾病的診斷和治療原則 熟悉：感染性疾病病原學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷及抗生素治療的主要實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)方法 了解：病原學(xué)診斷的重要性，現(xiàn)代感染的類型和病原微生物的變遷,病原體檢查的作用,1.感染性疾病的明確診斷 2.通過藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)臨床合理用藥 3.病原體監(jiān)控和耐藥性監(jiān)控,第一節(jié) 標(biāo)本采集、運(yùn)送和檢查方法,一.標(biāo)本采集和運(yùn)送,采集標(biāo)本注意點(diǎn)： 1.標(biāo)本容器必須無(wú)菌或清潔容器 2.選擇最佳時(shí)間采集標(biāo)本，在抗菌藥物使用前 3.獲取標(biāo)本時(shí)，須嚴(yán)格無(wú)菌操作 4.標(biāo)本采集后，應(yīng)盡快送實(shí)驗(yàn)室,血 液,發(fā)熱初期和高峰期采集 抗菌藥物治療前 成人每次10-20ml，嬰幼兒1-2ml 標(biāo)本不用抗

2、凝劑 24小時(shí)內(nèi)，可在不同部位采血3次,尿 液,無(wú)菌采集清潔中段尿 導(dǎo)尿或膀胱穿刺獲得,糞 便,取含膿、血或粘液糞便置于清潔容器內(nèi) 排便困難者或嬰幼兒可用直腸拭子 對(duì)傳染性腹瀉須三次送檢,呼吸道標(biāo)本,1.痰：自然咳痰法 氣管鏡采集法 2.鼻咽拭標(biāo)本：同痰標(biāo)本用清水漱口后采集,腦脊液與其他無(wú)菌體液,腦脊液標(biāo)本應(yīng)立即保溫送檢 胸腹水等體液標(biāo)本應(yīng)抽取2-5ml送檢,泌尿生殖道標(biāo)本,性傳播疾病取尿道口分泌物、陰道宮頸口分泌物 生殖道皰疹常穿刺取皰疹液,創(chuàng)傷、組織和膿腫標(biāo)本,開放性膿腫：無(wú)菌棉拭采集膿液 封閉性膿腫：無(wú)菌注射器穿刺抽取,二.病原體檢查的基本方法,1.臨床標(biāo)本細(xì)菌檢驗(yàn)一般程序,一般程序,標(biāo)

3、本,直接涂片，染色鏡檢 分離培養(yǎng) 增菌培養(yǎng) 需氧培養(yǎng),二氧化碳培養(yǎng) 厭氧培養(yǎng) 觀察菌落形態(tài) 單個(gè)菌落 涂片、染色鏡檢,血清學(xué)鑒定 生化鑒定 藥敏試驗(yàn),確定致病菌發(fā)出報(bào)告,2.病原體診斷的基本方法,直接顯微鏡檢測(cè)（microscopic examination） 染色標(biāo)本檢查法：革蘭染色和抗酸染色 不染色標(biāo)本檢查法：懸滴法和壓滴法,2.病原體診斷的基本方法,病原體分離培養(yǎng)(isolation and culture)和鑒定(identification) 培養(yǎng)基選擇 生長(zhǎng)條件：一般大氣條件 厭氧條件 微需氧條件,2.病原體診斷的基本方法,鑒定技術(shù)： 生化鑒定 血清學(xué)鑒定 數(shù)碼鑒定 自動(dòng)化鑒定,2

4、.病原體診斷的基本方法,血清學(xué)診斷：查特異性抗體肥達(dá)氏試驗(yàn) 病原體特異性抗原檢測(cè) 病原體核酸檢測(cè)：查特異基因片段DNA/RNAPCR、DNA探針雜交技術(shù),第二節(jié) 細(xì)菌耐藥性檢查,一.抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)（AST）,1.定義：對(duì)敏感性不能預(yù)測(cè)的臨床分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以指導(dǎo)臨床選擇治療藥物和了解區(qū)域或醫(yī)院內(nèi)常見病原菌耐藥性變遷，有助于臨床經(jīng)驗(yàn)性治療選藥。,一.抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)（AST）,2.常用敏感性試驗(yàn)方法 手工試驗(yàn):K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法 結(jié)果表示:S-Susceptible I-Intermediate R-Resistant 稀釋法（MIC） Etest 聯(lián)合藥敏試驗(yàn),一.抗微生

5、物藥物敏感性試驗(yàn)（AST）,自動(dòng)化儀器 Vitek，Microscan 分子試驗(yàn) PCR直接檢測(cè)mecA基因 補(bǔ)充試驗(yàn) Nitrocefin,一.抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)（AST）,3.藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床抗生素劑量關(guān)系 敏感(S)一般劑量有效，推薦使用該抗生素用于臨床治療 中介(I)大劑量有效，提示藥物MIC接近體液或組織可達(dá)到藥物濃度 耐藥(R)大劑量無(wú)效,即常規(guī)用藥劑量不能達(dá)到MIC,一.抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)（AST）,4.K-B紙片擴(kuò)散試驗(yàn)的影響因素 瓊脂厚度 與抑菌圈直徑成反比 菌液濃度 與抑菌圈直徑成反比 藥敏試紙 含量與抑菌圈直徑成反比 保存溫度20，使用前室溫平衡 30min后開

6、啟 濕度-密封容器，硅膠防潮 NCCLS標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng)種類(MH),厚度(4mm) 接種量(0.5MF) 選藥標(biāo)準(zhǔn),判讀標(biāo)準(zhǔn),質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),質(zhì)控參考菌,金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 大腸埃希菌 ATCC 25922 銅綠假單胞菌 ATCC 26853,二.耐藥機(jī)制及耐藥性監(jiān)測(cè)試驗(yàn),1.耐藥菌株： 耐甲氧西林葡萄球菌（MRS） 耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP） 耐萬(wàn)古霉素腸球菌（VRE） 質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBL） 多重耐藥的銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌和不動(dòng)桿菌,二.耐藥機(jī)制及耐藥性監(jiān)測(cè)試驗(yàn),2.耐藥機(jī)制： 藥物滲入細(xì)菌減少 產(chǎn)生滅火酶和鈍化酶(-內(nèi)酰胺酶) 細(xì)菌抗生素結(jié)合蛋白發(fā)生改

7、變（PBP） 代謝拮抗劑產(chǎn)生,二.耐藥機(jī)制及耐藥性監(jiān)測(cè)試驗(yàn),3.耐藥性監(jiān)測(cè)的特殊試驗(yàn) -內(nèi)酰胺酶檢測(cè) 方法:頭孢哨噻吩濾紙片法(nitrocefin) 意義: -內(nèi)酰胺酶檢測(cè)陽(yáng)性,即對(duì)青霉素、氨卞西林等抗生素耐藥,二.耐藥機(jī)制及耐藥性監(jiān)測(cè)試驗(yàn),超廣譜-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)（ESBL） 定義：是水解青霉素，一代、二代和三代頭孢菌及單酰胺類藥物的酶，產(chǎn)生ESBL的細(xì)菌對(duì)上述抗生素耐藥。 ESBL主要存在于大腸桿菌和肺炎克雷伯菌等革蘭陰性菌中。,二.耐藥機(jī)制及耐藥性監(jiān)測(cè)試驗(yàn),超廣譜-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)（ESBL） 方法：紙片擴(kuò)散法和稀釋法 意義：ESBL陽(yáng)性預(yù)示對(duì)頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松和氨曲南等抗

8、菌藥物無(wú)效。,二.耐藥機(jī)制及耐藥性監(jiān)測(cè)試驗(yàn),瓊脂篩選試驗(yàn)（agar screen test） 是以單一藥物單一濃度檢測(cè)細(xì)菌耐藥性，如耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬(wàn)古霉素腸球菌檢測(cè)。,二.耐藥機(jī)制及耐藥性監(jiān)測(cè)試驗(yàn),耐藥基因檢測(cè) 如MRSA中mecA基因檢測(cè),耐藥性統(tǒng)計(jì)和分析,WHONET 建立本院、本地區(qū)和本國(guó)的細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò),第三節(jié) 醫(yī)院感染檢查（Nosocomial Infection）,醫(yī)院感染檢查,1.定義:病人入院時(shí)不存在,也不處于潛伏期，而在醫(yī)院內(nèi)發(fā)生的感染，包括醫(yī)院內(nèi)獲得而在出院后發(fā)病的感染。,醫(yī)院感染檢查,2.醫(yī)院感染常見病原體（細(xì)菌）：革蘭陰性桿菌、革蘭陽(yáng)性球菌（MRSA

9、）、厭氧菌和深部真菌等,醫(yī)院感染檢查,3.感染源: 外源或內(nèi)源性病原體 外源性：其他住院患者、醫(yī)務(wù)人員、探望者（多為條件致病菌） 內(nèi)源性：患者自身皮膚、口腔、咽部和胃腸道固有的正常菌群等（免疫力低下患者）,醫(yī)院感染檢查,4.常見臨床類型 下呼吸道感染 尿路感染 手術(shù)切口感染 胃腸道感染 血液感染 皮膚和組織感染,醫(yī)院感染檢查,5.感染途徑： 接觸傳播 空氣、飛沫傳播 經(jīng)注射或輸液、輸血傳播 經(jīng)口傳播,醫(yī)院感染檢查,6.易感因素： 年齡：老年和嬰幼兒 慢性疾病患者 基礎(chǔ)疾病或醫(yī)源性 燒傷或創(chuàng)傷產(chǎn)生壞死性組織 大量使用抗生素 接受侵襲性治療操作,醫(yī)院感染檢查,7.醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測(cè) 尿液標(biāo)本

10、病原菌大腸埃希菌，變形桿菌，肺炎克雷伯氏菌，腸球菌，金黃色葡萄球菌，銅綠色假單胞菌 菌落計(jì)數(shù)104/ml以上尿路感染,醫(yī)院感染檢查,7. 醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測(cè) 痰（咽拭子）培養(yǎng) 病原菌肺炎鏈球菌，肺炎克雷伯氏菌，大腸埃希菌，腸球菌，金黃色葡萄球菌，銅綠色假單胞菌等 半定量3+4+為致病菌，1+2+懷疑為污染菌,醫(yī)院感染檢查,7. 醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測(cè) 痰（咽拭子）培養(yǎng) 甲型溶血性鏈球菌是亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎的主要致病菌,醫(yī)院感染檢查,7. 醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測(cè) 糞培養(yǎng) 病原菌金黃色葡萄球菌，傷寒及其他沙門氏菌，志賀氏菌屬，致病性大腸埃希菌，霍亂弧菌，副溶血性弧菌，彎曲菌，念珠菌等,醫(yī)院感染檢查,7.醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測(cè) 血培養(yǎng)： 病原菌：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等 單次血培養(yǎng)不易區(qū)分污染菌或感染菌。 兩次培養(yǎng)均為同種皮膚正常菌群可認(rèn)為感染菌。,醫(yī)院感染檢查,8.醫(yī)院環(huán)境監(jiān)測(cè)和消毒滅菌監(jiān)測(cè) 空氣培養(yǎng)：沉降法采樣 物體表面監(jiān)測(cè)：壓印法 醫(yī)務(wù)人員手部細(xì)菌監(jiān)測(cè) 消毒滅菌效果監(jiān)測(cè),小 結(jié),復(fù)習(xí)思考題： 名詞解釋：微生物直接檢測(cè)、微生物非培養(yǎng)檢測(cè)、醫(yī)院