1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù),一、課題背景,尿素是怎樣被植物吸收的？,尿素 CO(NH2)2,只能被分解為NH3才能被植物吸收利用,產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌即為能分解尿素的細(xì)菌,任務(wù)1：怎么從土壤中分離出它們呢？,二、研究思路,閱讀課本P21，感悟科學(xué)家尋找 耐高溫的DNA聚合酶給你的啟示。,（一）篩選菌株,方法： 人為提供有利于目的菌株生長 的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等）， 同時抑制或阻止其他微生物的生長。,4,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,有 無 凝固劑瓊脂,分離 鑒定,工業(yè) 生產(chǎn),（1）按物理性質(zhì)劃分：,培養(yǎng)基,5,天然培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基,化學(xué)成分不恒定的天然有機物,如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

2、、馬鈴薯培養(yǎng)基,化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基,如：高氏1號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基。用于分類和鑒定,（2）按化學(xué)成分劃分：,6,基礎(chǔ)培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基,含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì),將某種類微生物從混雜的微生物群體中分離出來,用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基,（3）按用途劃分：,7,幾種選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基,分離酵母菌、霉菌等真菌,不加氮源的無氮培養(yǎng)基,分離固氮菌,不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基,分離自養(yǎng)型微生物,根據(jù)這一思路，你能否將土壤中分解 尿素的細(xì)菌分離出來，說說你的思路。,利用以尿素為唯一氮源 的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。,能。只有產(chǎn)生 脲酶的細(xì)菌才能利用尿素作

3、為氮源而生存。,此培養(yǎng)基 能否篩選 出產(chǎn)生脲 酶的細(xì)菌？ 為什么？,KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO47H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 瓊脂 15.0g 將上述物質(zhì)溶解后，用 蒸餾水定容到1000mL。,（一）篩選菌株,1、利用選擇培養(yǎng)基篩選,在微生物學(xué)中，允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,選擇培養(yǎng)基：,1、利用尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基 分離出的微生物 只是一種細(xì)菌嗎？ 都是能分解尿素的微生物嗎？,思考：,不是，有多種。,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿

4、素。,不一定。因為有些微生物可以利用 其他微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行生長繁殖。 還有固氮微生物。,因此，還需借助生物化學(xué)方法 對分離的細(xì)菌作進(jìn)一步的鑒定。,都是能分解尿素的微生物嗎？,2、請你提供一種方法，判斷分解 尿素的細(xì)菌確實能將尿素分解成氨。,思考：,方法：在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基 中加入酚紅指示劑,接種培養(yǎng)該細(xì)菌，若 指示劑變紅，說明該種菌分解了尿素。,3、要驗證以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基 對土壤中的細(xì)菌確實具有選擇作用，你 該如何設(shè)計實驗。,思考：,思路：制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照組，尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基為實驗組，接種等量的從同一土壤中采集的細(xì)菌，培養(yǎng)、計數(shù)并比較兩組培養(yǎng)基上的菌落

5、數(shù)。,思考2： 統(tǒng)計每克土壤樣品中 究竟含有多少這樣的細(xì)菌？,計數(shù)法,活菌計數(shù)法 顯微鏡直接計數(shù)法 比濁法 濾膜法,1.稀釋涂布平板法（活菌計數(shù)法） 原理：當(dāng)樣品稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中含有多少活菌。（即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。）,（2）計算：每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,17,例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1、甲

6、同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。 你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？,甲：沒有重復(fù)實驗（至少涂布3個平板） 乙：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值,?,18,注意事項 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在 30300的平板上進(jìn)行計數(shù)。 為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到 三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng) 計算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。 涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般 以三個稀釋度中的

7、第二個稀釋度所出現(xiàn)的 平均菌落數(shù)在50個左右為最好。,2、顯微鏡直接計數(shù),利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度； 個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點,討論,對同一細(xì)菌培養(yǎng)液樣品分別用顯微鏡 直接計數(shù)法和稀釋涂布平板法測定其 菌體數(shù)量，你認(rèn)為兩種方法所測數(shù)據(jù) 有何差異？,設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中 對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的 。為了排除培養(yǎng)基是否被雜菌污染了，需培養(yǎng) 的培養(yǎng)基作為空白對照。,設(shè)置對照,實例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基

8、中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。,原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),非測試因素,可信度,未接種,小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實驗,方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,23,謝謝合作！,二、實驗設(shè)計 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3c

9、m左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前都要滅菌。,25,準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。,.制備培養(yǎng)基：,26,（三）樣品的稀釋,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。依次等比稀釋至106稀釋度 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行。,27,分離不同的微生物采用不同的稀釋度，其原因是 ，其目的是保證獲得 的平板。 細(xì)菌稀釋度一般為

10、 ， 放線菌稀釋度為 ， 真菌稀釋度為 。,不同微生物在土壤中含量不同,菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù),104、105、106,103 、 104、105,102、103、104,28,為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,答：這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,P24旁欄思考

11、題,29,.取樣涂布,實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,選取適合的稀釋范圍分別吸取0.1 mL進(jìn)行平板涂布操作。如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。,30,計算公式：,每克樣品中的菌株數(shù) =（CV）M,31,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2

12、528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,32,將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生。 比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。,33,在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出相同而穩(wěn)定的菌落特征。這些特征包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面,34,關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。,35,關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。,36,關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。,3

13、7,關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。,38,思考在研究未知微生物時務(wù)必規(guī)范操作，以防被 感染，實驗后一定要洗手。,致病微生物,三、操作提示,閱讀P25頁,1、無菌操作 2、做好標(biāo)記 3、制定時間,39,四.結(jié)果分析與評價 1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。 2.提示：選擇每個平板上長有30300個菌落的稀釋倍數(shù)計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。,40,41,42,五 課題延伸,怎樣對分離的菌種作進(jìn)

14、一步的鑒定?,2. 怎樣判斷細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生？,3. 怎樣鑒定某細(xì)菌能夠分解尿素？,43,五 課題延伸,怎樣對分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定?,2. 怎樣判斷細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生？,3. 怎樣鑒定某細(xì)菌能夠分解尿素？,借助生物化學(xué)的方法,44,五 課題延伸,怎樣對分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定?,借助生物化學(xué)的方法,CO（NH2）2 + H2O,CO2+2NH3,脲酶,2. 怎樣判斷細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生？,45,五 課題延伸,怎樣對分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定?,借助生物化學(xué)的方法,CO（NH2）2 + H2O,CO2+2NH3,脲酶,通過檢測培養(yǎng)基pH變化來判斷,2. 怎樣

15、判斷細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生？,46,五 課題延伸,怎樣對分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定?,2. 怎樣判斷細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生？,3. 怎樣鑒定某細(xì)菌能夠分解尿素？,借助生物化學(xué)的方法,通過檢測培養(yǎng)基pH變化來判斷,47,五 課題延伸,怎樣對分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定?,2. 怎樣判斷細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生？,3. 怎樣鑒定某細(xì)菌能夠分解尿素？,借助生物化學(xué)的方法,通過檢測培養(yǎng)基pH變化來判斷,在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅 指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指 示劑將變紅 ，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。,48,請根據(jù)以上配方，回答下列問題： (1)該培養(yǎng)基含有微生物所需要的_類營養(yǎng) 物質(zhì)。其中最主要的碳源是_，氮源是 _。 (2)該培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分是_培養(yǎng)基； 按培養(yǎng)基的作用劃分是_培養(yǎng)基。,4,葡萄糖,尿素,固體,選擇,例：下面是分離分解尿素的細(xì)菌所用的培養(yǎng)基配方,49,(3)該培養(yǎng)基具有選擇作用的原因是 。,該培養(yǎng)基中，唯一的氮源是尿素，只有能分解 尿素的