1、血清堿性磷酸酶活性測定,磷酸苯二鈉法,小組成員：,程展鵬，楊秋月，陳敬根，盧昆,實驗?zāi)康?熟悉酶活性測定方法的一般原理 掌握血清ALP測定原理與臨床意義,實驗原理,在PH10 環(huán)境中，ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，苯酚與4-氨基安替比林反應(yīng)生成色素原，該色素原經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌亞衍生物。測定紅色物質(zhì)的吸光度就可以計算酶活性的大小。 反應(yīng)式如下： ALP磷酸苯二鈉+H2O苯酚+磷酸氫二鈉 pH10 鐵氰化鉀 苯酚+4-氨基安替比林紅色醌亞胺衍生物,實驗器材和試劑：,（一）器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可調(diào)式移液器，721E分光光度計，1cm比色皿，

2、37 恒溫水浴 （二）試劑： 10.1mol/L碳酸鹽緩沖液(pH10.0) 稱取無水碳酸鈉6.36g，碳酸氫鈉3.36g，4-氨基安替比林1.5g，加蒸餾水溶解至1000ml。置棕色瓶中保存。 220mmol/L磷酸苯二鈉溶液 先將400ml蒸餾水煮沸，稱取磷酸苯二鈉2.18g(磷酸苯二鈉如含2分子結(jié)晶水，則應(yīng)稱取2.54g)加入煮沸的蒸餾水中使其溶解，冷卻后用煮過的冷蒸餾水加至500ml，再加氯仿2ml，置冰箱保存，此為底物溶液。 3鐵氰化鉀的硼酸溶液 稱取鐵氰化鉀2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸餾水400ml中，兩液混合后，加蒸餾水至1 000ml，置棕色瓶中避光保存(如出現(xiàn)藍綠色即棄去

3、)。 4酚標準工作液（0. 05mg/ml）：購買合格的二級標準品。,實驗操作,取試管4支，按下表操作：,立即混勻。用510nm波長比色，以蒸餾水調(diào)零點，讀取各管吸光度。 計算 ALP活性=（A測定A對照）/（A標準A空白）*0.05*100(金氏單位）,標準曲線法,制備如下： 取試管6支，分別加酚標準液(1ml=01mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加復(fù)合基質(zhì)液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml?；靹蚝?7水浴保溫5分鐘，各管加入1.0ml堿性溶液，再加0.5鐵氰化鉀2.0ml，立即混勻。靜置10分鐘，510nm波長下比色。將以上各管所得讀數(shù)

4、與其相應(yīng)的堿性磷酸酶單位(依次為0.5、10、20、30、40單位)在坐標紙上作圖，繪制成標準曲線。,臨床意義,在臨床上，血清ALP測定常作為肝膽疾病和骨骼疾病的臨床輔助診斷指標。 1血清ALP活性升高 ： 肝膽疾?。鹤枞渣S疸、急性或慢性黃疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾?。河捎诠堑膿p傷或疾病使成骨細胞內(nèi)所含高濃度的ALP釋放進入血液中，引起血清ALP活性增高，如纖維性骨炎、成骨不全癥、佝僂病、骨軟化病、骨轉(zhuǎn)移癌和骨折修復(fù)愈合期等。 2血清ALP活性降低： 比較少見，主要見于呆小病，ALP過少癥，維生素C缺乏癥。,注意事項,1底物溶液中不應(yīng)含有游離酚，如有酚則空白管顯紅色，說明磷酸苯二鈉已經(jīng)開始分解，應(yīng)棄去不用。 2鐵氰