1、第二章 生化制藥的基本技術(shù),第一節(jié) 原料的選擇、處理及有效成分的提取,生化藥物的提取與分離方法因原材料、藥物的種類和性質(zhì)不同而存在很大差異。總的來說，其提取純化一般分為五個步驟：預(yù)處理、固液分離、提取、精制和成品加工（包括干燥、制丸、擠壓、造粒、制片等步驟），如圖所示：,生物材料、發(fā)酵或培養(yǎng)液 預(yù)處理（清洗、加熱、調(diào)pH、凝聚、絮凝） 細(xì)胞分離（沉降、離心、過濾） 細(xì)胞 細(xì)胞破碎（高壓均質(zhì)處理、研磨、溶菌處理） 收集上清液 初步純化（沉淀、吸附、萃取、過濾） 高度純化（離子交換色譜、親和色譜、疏水色譜、吸附色譜及電泳等） 成品加工（無菌過濾、超濾、濃縮、冷凍干燥、噴霧干燥、結(jié)晶等） 圖2-1

2、生化藥物提取的一般工藝流程,上清液（含胞外產(chǎn)品）,一、原料的選取與保存,選擇原則：有效成分含量高，原料新鮮； 原料來源豐富，易得，原料成本低； 原料中雜質(zhì)含量較少等。 植物材料確定后，要選擇合適的季節(jié)、地點、時間后采集并就地去除不用的部分，將有用的部分保鮮處理。 保存生物材料的方法主要方法有冷凍法，常用-40速凍；有機溶劑脫水法；防腐劑保鮮法。,二、生化藥物提取,1. 物理性質(zhì)與提取 提取是利用目的物的溶解特性，將其與細(xì)胞的固形成分或其它結(jié)合成分分離，使其由固相轉(zhuǎn)入液相或從細(xì)胞內(nèi)的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入特定溶液環(huán)境的過程。 許多生化藥物具有生物活性，其穩(wěn)定性受pH、溫度、離子強度、金屬離子、提取過程中所

3、使用的溶劑等環(huán)境因素的影響。,2. 提取的溶劑系統(tǒng),（1）對水溶性、鹽溶性生物物質(zhì)的提取 可用酸、堿、鹽水溶液為提取劑。 （2）對水、鹽系統(tǒng)無法提取的蛋白質(zhì)或酶的提取 可用表面活性劑或有機溶劑提取，用有機溶劑作為提取試劑時，根據(jù)產(chǎn)物存在的狀態(tài)可分為液-液提取和固-液提取。,液-液提取也即萃取，也是利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相中分配系數(shù)不同而進行的提取分離的方法。,在一定溫度和壓力下，溶質(zhì)分配在兩個互不相溶的溶劑中達到平衡后，溶質(zhì)在這兩相的濃度比為一常數(shù)K，此常數(shù)稱為分配系數(shù)。 在常溫下為常數(shù)；的單位通常用mol/L或質(zhì)量單位/mL。,工業(yè)生產(chǎn)中常用的萃取溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等

4、。,表2 青霉素在不同萃取劑中的分配系數(shù),溶 劑 pH2.5（溶劑/水） pH7.0（溶劑/水）,乙酸戊酯 45/1 1/235 乙酸丁酯 47/1 1/186 乙酸乙酯 39/1 1/260 氯仿 39/1 1/220 三氯乙烯 21/1 1/260 乙醚 12/1 1/190,表1 在生物轉(zhuǎn)化中萃取溶劑的選擇準(zhǔn)則,固-液提取也稱為浸取。為了高效、快速地從固體中將目的物浸取出來，同時盡可能將雜質(zhì)留在固體中，選擇合適的溶劑很重要，溶劑選擇的主要依據(jù)是“相似相溶”原理。 浸取常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等極性溶劑和乙醚、氯仿、苯等非極性溶劑。,無論采用哪種溶劑系統(tǒng)對目的物進行提取，在提

5、取過程中都要盡量增加目的物的溶出度，并盡可能減少雜質(zhì)的溶出度，同時充分重視目的物在提取過程中的活性變化。,三、細(xì)胞破碎技術(shù),植物細(xì)胞模式圖,1. 機械法：包括球磨法、高壓勻漿法、超聲破碎法、X-press等。,JJ-2組織搗碎勻漿機,超聲波破碎儀,2. 非機械法：酶溶法、化學(xué)滲透法、反復(fù)凍融法、干燥法等,酶溶法的缺點在于酶的價格昂貴限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中的使用，雖然條件溫和、具有選擇性。細(xì)胞懸浮液中加入酶能迅速和細(xì)胞壁反應(yīng)并破壞它們。酶選擇性的催化細(xì)胞壁反應(yīng)，不破壞細(xì)胞內(nèi)的其它物質(zhì)。,四、固液分離,固液分離的方法很多，有重力沉降、離心分離和過濾等。,離心：借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力的作用，促使

6、不同大小，不同密度的粒子分離的技術(shù)。 過濾：在一定的壓力差下，利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分離的方法稱為過濾。,第二節(jié) 沉淀技術(shù),沉淀：是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)的溶解度降低、生成固體凝聚物的現(xiàn)象。 根據(jù)沉淀機理不同，可分為鹽析法、有機溶劑沉淀法和等電點沉淀法等。,一、鹽析法,水溶液中蛋白質(zhì)的溶解度一般在生理離子強度范圍內(nèi)（0.150.2mol/L）最大，低于或高于此范圍時溶解度均降低。蛋白質(zhì)在高離子強度的溶液中溶解度降低，發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為鹽析。不同蛋白質(zhì)鹽析時所需的鹽的濃度不同，因此調(diào)節(jié)鹽的濃度，可以使混合蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)分段析出，達到分離純化的目的。 常用的鹽析用

7、鹽包括硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉等。,二、有機溶劑沉淀法,向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑、降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法稱為有機溶劑沉淀法。,許多能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)。,三、等電點沉淀法,兩性電解質(zhì)在溶液pH處于等電點時，分子表面電荷為零，導(dǎo)致賴以穩(wěn)定的電荷層及水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。 調(diào)節(jié)溶液pH值，使兩性溶質(zhì)溶解度下降，析出沉淀的操作稱為等電點沉淀法。,第三節(jié) 色譜技術(shù),色譜：也稱層析，是根據(jù)混合物中溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起遷移速度不同而進行分離的方法。 固定

8、相：固定相是色譜的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。 流動相：在色譜過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱色譜中一般稱為洗脫劑，薄層色譜時稱為展層劑。,一、色譜技術(shù)的分類 色譜技術(shù)根據(jù)流動相的物態(tài)不同可以分為氣相色譜法、液相色譜法和超臨界流體色譜法。根據(jù)固定相的形狀不同，色譜法可分為柱色譜法、紙色譜法和薄層色譜法。根據(jù)分離的機理，可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法和親和色譜法。,二、柱色譜裝置和操

9、作,柱色譜一般由進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀及部分收集器等部分組成。 柱的分離效率與柱高成正比，與直徑成反比。,柱色譜操作,（1） 裝柱。根據(jù)欲分離的物質(zhì)性質(zhì)選擇適宜的色譜介質(zhì)，裝柱時，將洗脫劑與一部分緩沖液調(diào)成漿料后邊攪拌邊慢慢加入，一次用完。然后用幾倍柱床體積的緩沖液平衡色譜柱。 （2）加樣。將平衡后的色譜柱從柱頂部或底部進樣。 （3）洗滌。用與前組成相同的緩沖液流經(jīng)色譜柱，將未與固定相結(jié)合的雜質(zhì)洗滌下來。 （4）洗脫。根據(jù)目的物的性質(zhì)，選用一定組成的洗脫液將目的物洗脫下來。 （5）再生。目的物洗脫下來后，洗脫液成分及雜質(zhì)被吸附在色譜柱中，要進行再生后才能繼續(xù)使用。,三、吸附色譜,固定相

10、：固體為吸附劑，如硅藻土、硅膠、氧化鈣、淀粉、活性炭等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理：利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附能力不同而使混合溶液中各組分相互分離的方法。,在吸附色譜中，溶質(zhì)在色譜柱中的移動情況常以阻滯因數(shù)Rf來表示，是在層析系統(tǒng)中溶質(zhì)的移動速度和流動相的移動速度之比。 Rf =溶質(zhì)的移動速度/流動相的移動速度之比 =溶質(zhì)的移動距離/流動相的移動距離之比,四、凝膠過濾色譜,原理：按分子大小分離。凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可對大小流動產(chǎn)生不同的阻滯作用。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大

11、分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小， 故在最后出峰。,1.凝膠過濾色譜的分離機理 固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；,2. 凝膠的種類和性質(zhì),（1）葡聚糖凝膠 商品名為Sephadex，由葡聚糖和環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下交聯(lián)而成。主要型號是G-10G-200。數(shù)字是凝膠的吸水量（每克干膠膨脹時吸水的毫升數(shù)）的10倍。 （2）聚丙烯酰胺凝膠 商品名為Bio-gel-P。主要型號有Bio-gel-P-2 Bio-gel-P-300等10種。后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極限（不能擴散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的分子量）的10-3，所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。 （3）瓊脂糖凝膠 （4）其他

12、 多孔玻璃珠和多孔硅膠等。,3. 凝膠色譜的應(yīng)用,（1）脫鹽及除去小分子雜質(zhì)和溶液的濃縮。 （2）濃縮。利用凝膠顆粒的吸水性可對大分子樣品溶液進行濃縮。 （3）生物大分子的純化及生化藥物中熱源物質(zhì)的去除。 （4）分子量測定。在一定范圍內(nèi)，各個組分的洗脫體積Ve與其分子量的對數(shù)成線性關(guān)系。,五、離子交換色譜,固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂； 流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液； 基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長； 應(yīng)用：

13、離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。,六、親和色譜,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。,先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。,第四節(jié) 結(jié)晶,一、結(jié)晶的原理,1.飽和溶液 2.過飽和溶液 3. 晶核：在過飽和溶液中，最先析出的微小顆粒就是以后結(jié)晶的中心，稱為晶核。,結(jié)晶的過程,1. 形成過飽和溶液。 2. 晶核的形成。 3. 晶體的生長。,其中，溶液達到過飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提，過飽和度是結(jié)晶的推動力。,二、結(jié)晶的

14、過程,過飽和溶液的形成 （1）熱飽和溶液冷卻 適合溶解度隨著溫度降低而顯著減小的情況。 （2）部分溶劑蒸發(fā)法 蒸發(fā)法是使溶液加壓、常壓或減壓下加熱，蒸發(fā)除去部分溶劑達到過飽和的結(jié)晶方法。 （3）化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法 通過加入反應(yīng)劑或調(diào)節(jié)pH生成一個新的溶解度更低的物質(zhì)，當(dāng)其濃度超過它的溶解度時，就結(jié)晶析出。 （4）鹽析法,2. 晶核的形成,在工業(yè)結(jié)晶中，有3種不同的起晶方法： 一種是自然起晶法，即在一定溫度下使溶液進入不穩(wěn)定區(qū)，形成符合要求的晶核后加入稀溶液使溶液進入亞穩(wěn)定區(qū)，溶質(zhì)在晶核表面長大。 第二種是刺激起晶法，即將溶液蒸發(fā)進入亞穩(wěn)定區(qū)后加以冷卻，使之進入不穩(wěn)定區(qū)后產(chǎn)生一定的晶核，晶核析出后會

15、使溶液濃度降低在進入亞穩(wěn)定區(qū)，在亞穩(wěn)定區(qū)內(nèi)使晶體生長。 第三種是晶種起晶法，即將溶液蒸發(fā)或冷卻至亞穩(wěn)定區(qū)后投入一定數(shù)量和大小的晶種，使溶質(zhì)在所加晶種表面長大。,3. 晶體的生長,晶體生長：在過飽和溶液中已有晶核或加入晶種后，以過飽和度為推動力，晶種或晶核將長大，這種現(xiàn)象稱為晶體生長。 影響晶體生長的主要因素有： 雜質(zhì) 攪拌 溫度 過飽和度,三、晶體質(zhì)量控制,晶體的質(zhì)量主要指晶體的大小、形狀和純度三個方面。 重結(jié)晶是利用雜質(zhì)和結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑和不同溫度的溶解度不同，將晶體用合適的溶劑溶解，再次結(jié)晶，使其純度提高的操作。,四、結(jié)晶的應(yīng)用,工業(yè)結(jié)晶技術(shù)廣泛應(yīng)用于紅霉素、四環(huán)素、制霉菌素等抗生素及谷氨酸、賴氨酸等氨基酸的純化精制。,第五節(jié) 電泳,一、電泳原理與分類,將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動。某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。,電泳的類型,電泳主要有區(qū)帶電泳、等電點電泳和等速電泳等。,二、瓊脂糖凝膠電泳,三、聚丙烯酰胺凝膠電泳,四、SDS-PAGE,五、等電聚焦,第六