1、工業(yè)微生物與育種學實驗,Part 實驗基本操作技能 實驗三 微生物顯微技術,實驗三 微生物顯微技術,必做： 四大類微生物的鏡下特征 簡單染色 革蘭氏染色 酵母菌的計數 選做： 芽孢染色 微生物大小的測量,（1）簡單染色,涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢。 涂片：取兩塊潔凈無油的載玻片，各滴一小滴生理鹽水(或蒸溜水)于玻片中央，用接種環(huán)挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。 干燥、固定：將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。 染色：滴加染液12滴于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍染色12min，石炭酸復紅(或草酸銨結晶紫)染色約1min 。 水洗：傾去染液，用自來水從載玻片一端輕

2、輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。 干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。 鏡檢：涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。,注意： 滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。 干燥、固定時切勿離火焰太近，以防高溫破壞菌體形態(tài)。水洗時，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。 水洗時，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。,（2）革蘭氏染色,“三區(qū)”涂片法 ：在玻片的左、右端各加一滴蒸餾水，用無菌接種環(huán)挑取少量枯草芽孢桿菌與左邊水滴充分混合成僅有枯草芽孢桿菌的區(qū)域，并將少量菌液延伸

3、至玻片的中央。再用無菌的接種環(huán)調取少量大腸桿菌與右邊的水滴充分混合成僅有大腸桿菌的區(qū)域，并將少量的大腸桿菌液延伸到玻片中央，與枯草芽孢桿菌相混合含有兩種菌的混合區(qū)，干燥、固定。 要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色；涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。,革蘭氏染色,莢膜,（3）其他染色,芽孢染色,鞭毛染色,（4）微生物的計數,血球計數板 其他 培養(yǎng)法 OD值 重量法 代謝水平 比例計數,（一）以數量變化對微生物生長情況進行測定,1、顯微鏡直接計數法,1）常規(guī)方法：,采用細菌計數板或血球計數板，在顯微鏡下對微生物數量進行直接 計數（計算一定容積里樣品中微生物的數量）。,缺點： 不能區(qū)分死菌與

4、活菌； 不適于對運動細菌的計數； 需要相對高的細菌濃度； 個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；,原理：將1cm20.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計數其中的細胞數目，換算成單位體積中的細胞數。 適用范圍：個體較大細胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細菌等個體較小的細胞，因為（1）細菌細胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網格線，超出油鏡工作距離。 特點：快速，準確，對酵母菌可同時測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍可以區(qū)分死活細胞。,培養(yǎng)法,采用培養(yǎng)平板計數法要求操作熟練 、準確，否則難以得到正確的結果：,樣品充分混勻；,同一稀釋度三個以上重復,取平均值

5、；,每個平板上的菌落數目合適（30-300），便于 準確計數；,一個菌落可能是多個細胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成單位（colony forming units， CFU）來表示，而 不是直接表示為細胞數。,膜過濾培養(yǎng)法,當樣品中菌數很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣 品通過膜過濾器，然后將將膜轉到相應的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，對形 成的菌落進行統(tǒng)計。,The most probable number method（液體稀釋法）,對未知樣品進行十倍稀釋，然后根據估算取三個連續(xù)的稀釋度平行接種多支試管，對這些平行試管的微生物生長情況進行統(tǒng)計，長菌的為陽性，未長菌的為陰性，然后根據

6、數學統(tǒng)計計算出樣品中的微生物數目。,如某一細菌在稀釋法中的生長情況如下； 稀釋度 l0-3 10-4 10-5 l0-6 10-7 10-8 重復數 5 5 5 5 5 5 出現生長的管數 5 5 5 4 1 0 根據以上結果，在接種l0-310-5稀釋液的試管中5個重復都有生長，在接種l0-6稀釋液的試管中有4個重復生長，在接種10-7稀釋液的試管中只有1個生長，而接種10-8稀釋液的試管全無生長。由此可得出其數量指標為“541”，查最大或然數表得近似值17，然后乘以第一位數的稀釋倍數（10-5的稀釋倍數為100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌數17100 000 = 17105。即每

7、毫升原菌液含活菌數為l700000個。,OD法,在一定波長下，測定菌懸液的光密 度，以光密度(optical density, 即O.D.) 表示菌量。,實驗測量時應控制在菌濃度與光密度 成正比的線性范圍內，否則不準確。,通常根據經驗和目測推斷細菌的生長密度 要求較高的實驗采用分光光度計 一般OD600 需標準曲線,實驗中偶爾會出現菌液的OD值出現負值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應，發(fā)生變色反應。不能離心，保持懸浮。,重量法,以干重、濕重直接衡量微生物群體的生物量； 通過樣品中蛋白質、核酸含量的測定間接推算微生物群體的生物量；,測定多細胞絲狀真菌和高密度細菌生長情況的有效方法 大腸桿菌一個細胞一般重約10121013g，液體培養(yǎng)物中細胞濃度達到2109個/ml時，100ml培養(yǎng)物可得1090mg干重的細胞。,二 微生物生長的測定,生理指標法,微生物的生理指標，如呼吸強度，耗氧量、酶活性、 生物熱等與其群體的規(guī)模成正相關。 樣品中微生物數量多或生長旺盛，這些指標愈明顯， 因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量 熱計等設備來測定相應的指標。,常用于對微生物的快速鑒定與檢測,測含氮量 蛋白質是細胞的主要物質，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。