1、Regulation of Gene Expression in Eukaryotes,第二十一章,真核基因表達調控,1970年，猿猴病毒40(simian virus 40, SV40）的生命周期被確定為早、晚兩個階段，使它們成為基因表達調控的典型模型。,1975年D. Pribonow發(fā)現T7啟動子序列。,1982年C. Benoist和P. Chambon揭示了SV40的早期啟動子序列。,1983年，W.S.Dynan和R.Tjian分離、鑒定了真核轉錄因子AP1。,1986年，J.Clarke和Chambon兩個實驗室同時報告了SV40增強子的多功能元件組成。,1990年代，信號轉導-

2、基因轉錄偶聯機制成為熱點課題。,第 一 節(jié) 真核基因表達調控的特征 Features of Eukaryotic Gene Regulation,一、順式作用元件是決定真核基因轉錄活性的關鍵因素之一,（一） 啟動子是RNA聚合酶結合并啟動 基因轉錄的特異DNA序列,真核基因的啟動子指的是RNA聚合酶（RNA polymerase，RNA Pol）識別、結合的基因轉錄調控區(qū)中啟動基因轉錄的一段特異DNA序列，包含一組轉錄調控功能組件，其中每一個功能組件的DNA序列約720 bp。,1. 近起始點的TATA盒/起始子及CpG島 是真核生物啟動子的核心序列,真核細胞的啟動子是包括轉錄起始點（tran

3、scription initiation site或transcription start site）在內的、有通用轉錄因子及RNA聚合酶組裝、結合的一段DNA序列。,典型的啟動子核心序列（core sequences）是在轉錄起始位點上游2535 bp處，有一保守的TATA序列，被稱為TATA盒（TATA box），真核細胞的TATA盒多為TATAAAA序列。TATA盒與原核細胞的啟動子一樣，對RNA聚合酶II的轉錄起始位點起定位作用。,一些真核細胞基因含有另一種啟動子元件，稱為起始子(initiator,Inr)，決定啟動子的強度。,起始子共有序列為：（5）Y-Y-A+1-N-T/A-Y-

4、Y-Y（3）；Y代表胞嘧啶C或胸腺嘧啶T，N代表任意堿基，T/A代表T或A。,有一些編碼蛋白質基因的轉錄可有多個起始點，可產生含不同5末端的mRNA。,它們不含TATA盒或起始子，多在起始位點上游約100 bp內含有2050個核苷酸的CG序列，被稱做CpG島（CpG island）。,這些基因大多為低轉錄基因，編碼中間代謝酶的管家基因。,2. 啟動子中的上游元件協(xié)助真核基因調節(jié),啟動子上游元件（promoter-proximal elements, 或upstream promoter elements）是一些位于TATA盒上游的DNA序列，與調節(jié)蛋白結合，調節(jié)通用轉錄因子與TATA盒的結合、

5、RNA聚合酶與啟動子的結合，以及轉錄起始復合物的形成，從而決定基因的轉錄效率與專一性。 常見的序列是：,(二）增強子決定基因的時空特異性表達,增強子（enhancer）,是能夠結合特異基因調節(jié)蛋白，促進鄰近或遠隔特定基因表達的DNA序列；在酵母中，被稱為上游活化序列（upstream activator sequences, UASs）。,增強子的作用通常與其所處的位置和方向無關。,增強子距轉錄起始位點的距離變化很大，從100 nt到50,000nt，甚至更大。但總是作用于最近的啟動子。,增強子所處位置,在所調控基因的上游或下游，但主要位于上游。下游內含子當中，乃至下游最后外顯子以外的序列也可

6、含有增強子。,很多哺乳動物基因受一個以上的增強子調控。,（三）沉默子阻遏基因轉錄,沉默子(silencer)是指某些真核基因轉錄調控區(qū)中抑制或阻遏基因轉錄的一段（數百bp）DNA序列。沉默序列促進局部DNA的染色質形成致密結構，從而阻止轉錄激活因子結合DNA，是基因轉錄的負性調節(jié)因素。,二、反式作用因子和順式作用蛋白 是真核基因的轉錄調節(jié)蛋白,在真核細胞核中，有許多蛋白質能夠幫助RNA聚合酶轉錄RNA。這類蛋白質統(tǒng)稱轉錄因子（transcription factors，TF）或轉錄調節(jié)蛋白（transcription regulatory protein）。 以反式作用方式調節(jié)基因轉錄的轉錄因

7、子稱為反式作用因子（trans-acting factor），以順式作用方式調節(jié)基因轉錄的轉錄因子稱為順式作用蛋白（cis-acting protein） 。,反式調節(jié),順式調節(jié),（一）Pol轉錄需要基本轉錄因子和特異 轉錄因子,* 基本轉錄因子(general transcription factors),是RNA聚合酶結合啟動子所必需的一組蛋白因子，決定三種RNA(mRNA、tRNA及rRNA)轉錄的類別。,* 特異轉錄因子(special transcription factors),為個別基因轉錄所必需，決定該基因的時間、空間特異性表達。,轉錄激活因子,轉錄抑制因子,轉錄調節(jié)因子結構,

8、（二）轉錄因子含有不同的DNA結合域,螺旋-轉角-螺旋是轉錄因子中的常見的DNA結合域 同源異型域結構與HTH結構域類似 鋅指結構是一類含鋅離子轉錄因子的DNA結合域 亮氨酸拉鏈結構域既可介導結合DNA又可介導蛋白質二聚體化 堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構域也可同時介導結合DNA和蛋白質二聚體化,螺旋-回折-螺旋 （helix-turn-helix，HTH）,同源異型域 （homeodomain，HD）,鋅指結構是一類含鋅的DNA結合蛋白質模體,C2H2型鋅指（Zinc finger）,反向平行片層,DNA大溝,螺旋,Zn2,亮氨酸拉鏈同時調節(jié)DNA結合與蛋白質二聚體化,亮氨酸拉鏈（leucine z

9、ipper）,堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構也可調節(jié)DNA結合及蛋白質二聚體化,堿性螺旋-環(huán)-螺旋 （basic helix-loop-helix，bHLH）,（三）轉錄因子含有不同的轉錄激活域,富含谷氨酰胺的轉錄激活域 富含脯氨酸的轉錄激活域 酸性氨基酸轉錄激活域,三、正性調節(jié)占主導的真核基因表達調控機制更加復雜,*不同的DNA元件組合可產生多種類型的轉錄調節(jié)方式； * 多種轉錄因子又可結合相同或不同的DNA元件； * 轉錄因子與DNA元件結合后，對轉錄激活過程所產生的效果各異，有正性調節(jié)或負性調節(jié)之分。,第 二 節(jié) 真核基因表達的染色質 水平調控 Chromosomal Regulation of

10、 Eukaryotic Gene Expression,基因活化蛋白質改變局部染色質結構,異染色質（heterochromatin）是轉錄非活性的。,常染色質（euchromatin）中的轉錄活性區(qū)域對核酸酶敏感，特別是轉錄基因的5-側翼區(qū)1000 nt以內是高敏感位點(hypersensitive sites)。很多高敏感位點是調節(jié)蛋白質的結合序列，而這些區(qū)域核小體的相對缺少也使得這些蛋白質易于與之結合。,轉錄活化染色質與非活化染色質在結構上有很大不同。,轉錄活化染色質與非活化染色質的組蛋白共價修飾的方式也不相同。,核小體的核心組蛋白（H2A，H2B，H3，H4）中賴氨酸殘基的非可逆性甲基化

11、，絲氨酸與蘇氨酸殘基的磷酸化，乙酰化以及泛素化多是轉錄活性染色質的特點。,真核細胞DNA的CpG序列（CpG島）中的胞嘧啶被甲基化為5-甲基胞嘧啶是常見現象，但轉錄活性染色質區(qū)域胞嘧啶被甲基化的程度降低。,染色質重塑（chromatin remodeling）,基因活化蛋白質可以通過改變基因的啟動子和調節(jié)序列區(qū)域的染色質結構來促進轉錄開始。這種改變局部染色質結構的過程被稱為染色質重塑 。,最主要的兩種方式：,染色質重塑,組蛋白乙?；?位點：組蛋白乙?；D移酶（histone acetyl transferases, HATs），也稱組蛋白乙?；福╤istone acetylase）主要作用于

12、核小體的核心組蛋白所富含的賴氨酸殘基，降低整個核小體對DNA的親和性。,時間：基因活化蛋白質結合在轉錄調節(jié)區(qū)域后。,作用：使染色質進入轉錄活性狀態(tài)乙；還可能促進或防止與其他轉錄或調節(jié)相關蛋白的相互作用。,逆轉：組蛋白脫乙?；?histone deacetylase)減少核小體的乙?；?，使染色質恢復轉錄非活性狀態(tài)。,第 三 節(jié) 真核基因表達的轉錄水平調控 Transcriptional Regulation of Eukaryotic Gene Expression,基因表達的多級調控:,基因激活,轉錄起始 轉錄后加工 mRNA降解,基因轉錄激活調節(jié)基本要素:,基因的結構、性質,細胞內所存在的

13、轉錄調節(jié)蛋白,生物個體或細胞所處的內、外環(huán)境,真核細胞基因開關的分子機制比原核復雜,基本共同點：轉錄起始的調節(jié)是關鍵點,根本不同點：,原核生物：啟動子在缺少轉錄因子情況下就具有天然活性 真核生物：強力啟動子在缺少調節(jié)蛋白的情況下往往沒有活性,真核細胞基因及其調控區(qū)域受到染色質結構的限制，轉錄的活化與轉錄調控區(qū)域、轉錄區(qū)域內染色質結構的諸多變化相關；,正性調節(jié)是主要形式。因此，在轉錄的基本狀態(tài)受到制約的情況下，使得每個真核細胞基因需要活化才能被轉錄；,真核細胞有更大、更為復雜、種類更多的調節(jié)蛋白。單一啟動子可以被分散在DNA分子上、數量近乎無限的調節(jié)序列所控制。,真核細胞對基因表達起始的調控至少

14、在下面幾個方面與原核細胞存在不同：,一、轉錄起始調控發(fā)生在轉錄起始復合物的組裝過程,基因活化蛋白質與增強子或UASs的結合； 通用轉錄因子在啟動子處的組裝； 輔助激活子(coactivator)和/或中介子（medicator）在通用轉錄因子/RNA聚合酶II復合物與基因活化蛋白質之間的輔助和中介作用。,RNA聚合酶II與啟動子的結合、啟動轉錄需要諸多蛋白質因子的協(xié)同作用。這通常包括：,基因活化蛋白質與增強子結合后，通過與全酶復合體中的中介子相互反應，使全酶復合體在空間上更接近啟動子并有效組裝。,此外，多數全酶復合體中缺少一些通用轉錄因子，如TFIID與TFIIA，它們需要在啟動子處分別組裝，

15、最后形成穩(wěn)定的轉錄起始復合物（transcription initiation complex），啟動轉錄。,基因活化蛋白與增強子結合后如何影響到遠距離的RNA聚合酶結合位點，有以下幾種模式：,通過扭曲作用使DNA鏈發(fā)生構型變化，更適合于通用轉錄因子與RNA聚合酶結合, 并通過直接接觸或通過輔活化子/中介子而影響通用轉錄因子和RNA聚合酶的組裝。,扭曲（twisting）,沿DNA滑動，直到接觸另一個特異DNA序列結合的轉錄因子，發(fā)揮作用。,利用DNA分子的柔曲性彎曲成環(huán)，使增強子區(qū)域與RNA聚合酶結合位點靠近，直接接觸或通過輔活化子/中介子而發(fā)揮作用。,滑動（sliding）,成環(huán)（loop

16、ing）,固醇類激素、甲狀腺激素、維甲酸類激素等激素與細胞核內的特異性受體，即特異基因調節(jié)蛋白結合，形成的激素-受體復合物結合到DNA特定的基因調節(jié)序列激素反應元件(hormone response elements, HREs)，再通過與其他調節(jié)因子的相互作用，活化或抑制相鄰基因的表達。,幾種不同的激素反應元件,（一）mRNA 5端加帽和3端加尾修飾 利于mRNA穩(wěn)定性和轉運,除組蛋白外，所有真核細胞mRNA都有5端的“帽”和3端的Poly(A)尾結構 。,5端的“帽”和3端的Poly(A)尾均有其特有的作用。,二、轉錄后調控涉及修飾、剪接、編輯、定向轉運多個環(huán)節(jié),5加帽的作用在于：,有助于

17、保護mRNA免于被核糖核酸酶降解；,5帽結合蛋白復合體參與mRNA和核糖體的結合來起始翻譯 。,促進mRNA從細胞核運輸到細胞漿；,協(xié)助mRNA的剪接。在剪接第一個外顯子時，剪接體的形成需要帽結合蛋白的參與；,poly(A)尾可結合一種或多種特殊蛋白，避免mRNA被酶降解，并在翻譯過程中具有重要作用。許多原核mRNA也含有Poly(A)尾，但是此尾的功能是促進mRNA降解，而不是保護mRNA免于被降解。,poly(A)尾的作用：,（二）可變性剪接可使初始轉錄本產生不同的成熟mRNA,許多初始轉錄本可以通過一種以上的選擇性剪接（alternative RNA splicing）方式，去除不同的內

18、含子而被加工形成不同的mRNAs，因而形成不同的多肽。,人視黃醛還原酶mRNA的選擇性剪接,mRNA,Pre-mRNA,同種異型mRNA,初始轉錄本含有所有選擇性加工途徑所需要的分子信號。 一種細胞偏好何種選擇性加工途徑取決于加工因子RNA結合蛋白的特異性。,負調節(jié)：抑制蛋白質可以通過與原始轉錄本的結合來防止剪接復合體切除內含子序列。,選擇性剪接可以被正負調節(jié)分子調節(jié)：,正調節(jié)：而不能正常剪接的剪接復合體可以在活化蛋白的幫助下發(fā)揮剪接功能。,（三）編輯加工可增加mRNA分子信息的內涵,某些mRNAs在翻譯前被編輯(editing)。,結果：轉錄后編輯過程插入了4個U殘基，從而改變了轉錄本的翻譯

19、讀碼框。,機制：尚不清楚。研究人員已經發(fā)現線粒體轉錄一類特殊的RNA分子，其3端有一段 poly(U), 其5端序列與mRNAs被編輯的區(qū)域互補，被稱為引導RNA（guide RNA）。引導RNA可能作為編輯過程的模板，并將其3端的U轉移給被編輯的mRNAs。,（四）調解成熟mRNA的核外輸出也會 影響基因表達,現象：估計有1/5的核內成熟mRNAs能進入細胞漿。留在核內的mRNAs約在1小時內降解。mRNA通過核膜的過程是一個主動運輸過程，常常需要借助于核輸出受體(nuclear export receptors)才可穿過9nm的核孔通道。,機制：調控RNA從核運輸至細胞漿的機制還不很清楚。

20、,（五）某些mRNA定位于細胞質的特殊區(qū)域,現象：一些mRNA分子攜帶有信息，可以在翻譯開始前自我導向定位于細胞內的特定位置。,作用：在細胞的特定部位集中產生所需要的大量蛋白質。,機制：導向信號存在于mRNA的3端非翻譯區(qū)（3untranslated region, 3UTR）。,mRNA被連接在附著于細胞骨架上的動力蛋白（motor proteins）上，利用其水解ATP所提供的能量沿著骨架成分朝目的方向移動，最終在目的地被錨蛋白（anchor proteins）固定。,mRNA在細胞漿中隨機擴散并被不斷地降解，只有碰上錨蛋白才能得到保護。,mRNA通過在細胞漿中的隨機擴散，在其定位處被錨蛋

21、白捕捉、固定。,第二種情況,第三種情況,第一種情況,mRNA分子的3種不同定位過程,（六）通過改變mRNA分子的穩(wěn)定性 調控基因表達,意義：降解途徑保證mRNA不在細胞中累積并避免合成過多的蛋白質。,不同真核基因的mRNA的降解速率大不相同。,暫時需要的基因產物：半衰期可能僅為幾分鐘、甚至幾秒鐘。,經常需要的基因產物：其mRNA 可在多代細胞中穩(wěn)定存在。,真核細胞mRNA降解有兩種途徑，是由每種mRNA分子的序列所決定。,Poly(A)的逐漸短縮：最常見的途徑,mRNA分子一旦進入細胞漿中，核酸外切酶會使Poly(A)末端逐步短縮，當剩下約30個A時，5端發(fā)生脫帽，mRNA分子被迅速降解。,一

22、些mRNA分子的3UTR的特殊序列有助于特殊蛋白質的結合，增加或降低Poly(A)短縮的速度。,可將Poly(A)直接從mRNA分子上切除。這種切除也有賴于mRNA分子的3UTR特殊序列可以被內切酶識別。,另一個途徑始于特殊內切酶的作用,轉鐵蛋白受體(transferrin receptor, TfR) mRNA分子 3UTR柄環(huán)（stem-loop）結構鐵反應元件(iron-response element，IRE)。,例如：,IRE-BP對轉鐵蛋白受體mRNA穩(wěn)定性的調節(jié),（七）mRNA分子細胞質中添加Poly(A) 控制蛋白翻譯,在一些情況下，特殊的Poly(A)尾端可以在細胞漿得以延伸

23、。,例：正在成熟中的卵母細胞與卵細胞,一些存在于細胞漿的mRNA分子的3末端只有1030個腺苷酸（A），它們并不翻譯。在卵母細胞成熟和受精后的一個特定時段，當需要這些mRNA所編碼的蛋白質時，Poly(A)被添加到這些選定的mRNA分子，大大促進它們翻譯的開始。,（八）無義變化介導的mRNA降解是真核mRNA的監(jiān)視系統(tǒng),無義變化介導的mRNA降解 (Nonsense-mediated mRNA decay, NMD）,當在同一閱讀框架內的翻譯終止密碼子UAA、UAG或UGA提前出現在最后兩個外顯子交界處上游約50 nt處時，mRNA被迅速降解。這些錯位終止密碼子被稱為成熟前終止密碼子（prem

24、ature termination codons, PTC），可以來自突變、重組、不完全或不正確剪接。,無義變化介導的mRNA的降解,意義：,可以使某些異常的mRNA在被有效地翻譯成蛋白質前得到清除 ，這個mRNA監(jiān)視系統(tǒng)可以防止非正常截短的蛋白質的合成 。,NMD在進化過程中發(fā)揮了重要作用，使真核細胞更容易探究由于DNA重排、突變或不同剪接方式所形成的新基因。,免疫系統(tǒng)細胞的發(fā)育過程中也很重要，重排基因產生的這類mRNA被NMD系統(tǒng)迅速降解，避免了截短蛋白質的細胞毒作用。,（九）RNA干涉是一種基因轉錄后沉默機制,RNA干涉,在高等真核生物中發(fā)現有一類小RNAs (small RNAs)介導的特殊基因的沉默。這是由于此類小RNAs與mRNAs（經常是3U