1、如何分離鑒定氨基酸混合液？,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,氨基酸的薄層層析(Thin layer chromatography of amino acids),生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握薄層層析法的一般原理。 掌握氨基酸薄層層析法的基本操作技術(shù)。 掌握如何根據(jù)移動(dòng)速率（Rf值）來鑒定被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液）。,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,層析技術(shù),概念：是利用化合物中各組分的物理性質(zhì)的差別（如溶解度、吸附能力、分子形狀和大小、分子極性等）使各組分在兩相中的分布不同，從而使各組分以不同速度隨流

2、動(dòng)相向前移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。 特點(diǎn)：分離效率高，能分離各種性質(zhì)相類似的物質(zhì)。不僅可用于少量物質(zhì)的分離純分，也可用于大量物質(zhì)的分離純化和制備。,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,層析的基本過程,組分A 組分B,+ 流動(dòng)相,固定相,吸附 溶解 結(jié)合等,解除上 述作用,反復(fù)進(jìn)行,移動(dòng)速度不同,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,層析法的分類,氣相層析（以氣體為流動(dòng)相的層析法） 液相層析（以液體為流動(dòng)相的層析法，此為生物化學(xué)領(lǐng)域里常用的方法） 1.吸附層析：薄層吸附層析、吸附柱層析 2.分配層析：紙層析、柱層析、薄層層析 3.離子交換層析 4.凝膠層析：柱層析、薄膜層析

3、 5.親和層析,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,實(shí)驗(yàn)原理,1.薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種 一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動(dòng)時(shí)，由于吸附劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開來）,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,2. 氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng) 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它與氨基酸的羧基反應(yīng)生成還原茚三酮、氨及醛，與此同時(shí)，還原茚三酮又與氨及

4、茚三酮縮合生成藍(lán)色化合物而使氨基酸斑點(diǎn)顯色。,實(shí)驗(yàn)原理,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction),09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,實(shí)驗(yàn)原理,3.混合氨基酸被分離后在薄層層析圖譜上的位置用相對(duì)遷移率Rf值（rate of flow）來表示。 層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動(dòng)方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為Rf值。 由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動(dòng)速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,實(shí)驗(yàn)材料,吸附劑：硅膠 粘合劑： 0.5%的羧甲基纖

5、維素鈉 氨基酸的異丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展開-顯色劑（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） 分析樣品：氨基酸混合液,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,器材,層析板、尺子、鉛筆 燒杯、量筒 噴霧器、吹風(fēng)機(jī) 毛細(xì)管、層析缸 藥匙 烘烤箱,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,操作步驟 薄層板的制備,1、調(diào)漿 稱取硅膠3克，加0.5%的羧甲基纖維素鈉8毫升，調(diào)成均勻的糊狀。 2、涂布 取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層。 3、干燥 將玻璃板水平放置，室溫下自然涼干。 4、活化 70烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時(shí)取出。,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)

6、驗(yàn)教學(xué)中心,操作步驟 點(diǎn)樣,2cm,1cm,1、位置：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個(gè)點(diǎn)。每個(gè)樣品間相距1cm。 2、用毛細(xì)管分別吸取氨基酸溶液，輕輕接觸薄層表面點(diǎn)樣。 3、加樣后原點(diǎn)擴(kuò)散直徑不超過2mm。 4、待點(diǎn)樣點(diǎn)干后再重復(fù)點(diǎn)一次。,Ala Arg Gly Mix,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,操作步驟 展層、顯色,將薄層板點(diǎn)樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應(yīng)低于點(diǎn)樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當(dāng)展層劑前沿離薄板頂端2cm時(shí)，停止展層，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線，用熱風(fēng)吹干或在85下烘干，即可顯出各層斑點(diǎn)。,Ala Arg Gly Mix,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,注意事項(xiàng),1.切勿用手直接接觸薄層板面。 2.點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。 3.樣品量太少，有的成分不易顯示；樣品量太多，易造成斑點(diǎn)過大，互相交叉或拖尾。,09年秋季學(xué)期,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,Rf =,斑點(diǎn)至原點(diǎn)距離,溶劑前緣至原點(diǎn)距離,結(jié)果計(jì)算,小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心距離，再量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的距離，計(jì)算出它們的 值。 根據(jù)值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類，并繪出