1、真核表達系統(tǒng),酵母 絲狀真菌 昆蟲 哺乳動物細胞 轉基因動物 植物反應器,酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點,遺傳背景清楚（基因組是大腸桿菌的3.5倍） 增殖快（90min/代），培養(yǎng)容易，產(chǎn)量較高 易于研究突變與基因功能，如構建酵母人工染色體等 可以進行轉錄和翻譯后修飾加工 提純工藝復雜，成本高，制品純度達不到要求，制品免疫原性差，接種劑量大,酵母載體的基本結構,DNA復制起始區(qū)：2質(zhì)粒和自主復制序列 選擇標記：營養(yǎng)缺陷型和顯性選擇（抗藥） 整合介導區(qū)：同源重組，決定整合位置和拷貝數(shù) 有絲分裂穩(wěn)定區(qū)：幫助載體平均分配 表達盒 轉錄啟動子 終止子 分泌信號序列,酵母表達系統(tǒng)中載體的種類,按載體在酵母中的復制

2、形式分為： YIp：酵母整合型載體 YRp：酵母自主復制型載體 YCp：酵母含著絲粒片段載體 YEp：酵母附加體型載體 YAC：酵母人工染色體,昆蟲表達系統(tǒng),桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb 啟動子：桿狀病毒科核多角體病毒的多角蛋白強啟動子 表達系統(tǒng) 桿狀病毒表達系統(tǒng)（BEVS） 家蠶核型多角體病毒-家蠶表達系統(tǒng) 宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲 克隆基因方法：轉移載體共轉染同源重組空斑篩選純化重組病毒,桿狀病毒表達系統(tǒng)優(yōu)點,容量大：能插入12kb的外源基因 高表達：polh基因啟動子是目前所知的最強的真核啟動子；產(chǎn)物對宿主影響小；產(chǎn)

3、物可結晶 高效：可同時表達多個基因 安全：桿狀病毒對脊椎動物無病原性 具加工修飾功能：昆蟲細胞較高等 家蠶易飼養(yǎng),哺乳動物細胞表達表達系統(tǒng),常用宿主細胞 哺乳動物細胞常用載體 真核細胞表達元件 哺乳動物基因轉移的遺傳標記 基因表達的檢測方法,哺乳動物細胞表達的優(yōu)點,重組DNA易轉染，遺傳穩(wěn)定，可重復 識別和去除內(nèi)含子 進行翻譯后修飾 磷酸化、糖基化、二硫鍵、寡聚體等的形成、高級結構的正確折疊 產(chǎn)品的構型正確率高，可被改造成類人體源性，免疫源性好 可分泌至培養(yǎng)基，提純工藝簡單，成本低 可用于基因治療,常用宿主細胞,真核細胞表達元件,原核DNA序列 啟動子 增強子 拼接信號 終止子和多聚腺苷化信號

4、 篩選標記 動物病毒基因序列,原核DNA序列,原核復制子 抗生素抗性基因 多克隆位點,啟動子,真核啟動子：RNA聚合酶（）結合并起動轉錄的DNA序列 一般包括轉錄起始點及其上游約100-200bp序列，包含有若干具有獨立功能的DNA序列元件，每個元件約長7-30bp 核心啟動子元件：RNA聚合酶起始轉錄所必需的最小DNA序列，包括轉錄起始點及其上游-25/-30bp處的TATA盒。單獨起作用時只能確定轉錄起始位點和產(chǎn)生基礎水平的轉錄 上游啟動子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉錄起始點更遠的上游元件。與相應的蛋白因子結合改變轉錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件組

5、成，其位置也不相同，即不同的基因表達分別有不同的調(diào)控,哺乳類RNA聚合酶啟動子中常見的元件,常用啟動子,Rous肉瘤啟動子（RSV） 巨細胞病毒啟動子（CMV） SV40啟動子,增強子,增強子：是一種能夠提高轉錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)長約200bp的一段DNA，可使旁側的基因轉錄提高100倍，其后在多種真核生物、甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強子 增強子通常占100-200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，其基本核心組件常為8-12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在,增強子的作用特點,提高同一鏈上基因轉錄效率，可遠距離起作用，通常距離1-4kb、但遠至30kb仍能發(fā)

6、揮作用，在基因的上游或下游都能起作用 與其序列的正反方向無關 要有啟動子才能發(fā)揮作用。但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉錄 增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調(diào)控元件一樣，必須與特定的蛋白質(zhì)因子結合后才能發(fā)揮增強轉錄的作用 增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細胞或組織中具有特異性蛋白質(zhì)因子所決定的,常用增強子,LTR：Rous肉瘤病毒基因長末端重復序列 人類巨細胞病毒增強子 SV40病毒增強子,終止信號和poly A信號,真核基因轉錄的終止信號與機制還不明確 poly A增加mRNA的的穩(wěn)定性 多聚腺苷化

7、所需的兩種序列 位于poly A下游GU豐富區(qū)或U豐富區(qū) 位于poly A上游11-30bp處的5-AAUAAA SV40 poly A信號,遺傳性標記,胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng) 二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇系統(tǒng) 新霉素抗性基因（neo）選擇系統(tǒng) 氯霉素乙酰轉移酶基因（cat）選擇系統(tǒng),胸苷激酶（TK）基因選擇系統(tǒng),TK是核苷酸補救合成途徑的一個關鍵酶 內(nèi)源性缺陷tk的宿主細胞小鼠LMTK細胞 HAT選擇法 H：次黃嘌呤；補救合成三種核苷酸的原料 A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成 T：胸苷；補救合成dTTP的原料 tk細胞的鑒別與獲得：5-溴脫氧核糖尿苷（BUdR）篩選,二氫葉酸還原酶

8、（DHFR）基因選擇系統(tǒng),DHFR：真核細胞生物合成核苷酸的關鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸 篩選劑：葉酸類似物氨基喋呤或氨甲喋呤 dhfr缺陷型細胞CHO細胞 正常細胞可通過提高氨甲喋呤濃度篩選 突變型dhfr基因的導入擴大篩選宿主細胞的范圍,新霉素抗性基因選擇系統(tǒng),新霉素（neo）：即G418，一種氨基糖苷類抗生素，影響80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成 新霉素抗性基因編碼3-磷酸轉移酶降解G418 適用于所有的真核細胞,氯霉素乙酰轉移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng),CAT：大腸桿菌Tn9轉座子編碼的催化氯霉素乙酰化反應的蛋白質(zhì) 真核細胞缺乏CAT 導入CAT可作為報告基因 常用于瞬時表達研

9、究,表位標記,表位：抗原決定簇即抗原分子于一特定抗體結合的化學基團，一般由少至幾個氨基酸的多肽組成 用于重組DNA技術的示蹤、分析、純化（親和） 優(yōu)點 用一種抗體可鑒別不同重組蛋白 不影響蛋白功能 有利于研究蛋白功能 常用表位：6His；FLAG；LZ等,構建含表位的重組體,使用常用密碼子 注意克隆位點（限制性酶切位點）相符 5端加上起始密碼子ATG 3端加上終止密碼子 可插入蛋白酶切位點基因，以利于產(chǎn)生天然蛋白 其他常規(guī)構建載體的注意點,真核表達載體,質(zhì)粒：真核表達元件、真核抗性 病毒載體：改建后 SV40病毒 腺病毒 反轉錄病毒 痘苗病毒,病毒基因組的結構特點,病毒基因組大小相差較大,與細

10、菌或真核細胞相比，病毒的基因組很小 病毒基因組可以由DNA組成，也可以由RNA組成 多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的核糖核酸鏈組成 基因重疊即同一段DNA片段能夠編碼兩種甚至三種蛋白質(zhì)分子 病毒基因組的大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的 病毒基因組DNA序列中功能上相關的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定的部位,形成一個功能單位或轉錄單元 除了反轉錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次 噬菌體（細胞病毒）的基因是連續(xù)的；而真核細胞病毒的基因是不連續(xù)的,病毒載體優(yōu)點,真核細胞可識別的啟動子 報告基因 可持續(xù)復制（感染周期） 部分載體可整合入基因組 部

11、分載體本身帶有完整的復制及表達元件 部分載體具有宿主細胞特異性 識別受體 假病毒顆粒,猿猴空泡病毒（SV40）,種屬分類：乳多空病毒科多瘤病毒屬 雙鏈共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），5243bp 20面體立體對稱結構，直徑45nm 以EcoRl內(nèi)切酶切點作為0點分成100等分，Ori點是DNA雙向復制的起紿點 早期編碼進程是逆時鐘方向，在病毒DNA自制前，編碼的蛋白質(zhì)(大T、小T抗原)與誘發(fā)宿主細胞的轉化有關 晚期編碼區(qū)進程為順時鐘方向，是在病毒DNA復制開始以后，編碼的蛋白質(zhì)為三種病毒殼體蛋白VP1、VP2和VP3，這些蛋白是病毒的結構蛋白，不參與細胞的轉化過程,SV40感染細胞模式,感

12、染形式：隨宿主的不同產(chǎn)生的效應不同 許可性細胞裂解性感染（猿猴細胞） 非許可性細胞整合入染色體（嚙齒動物細胞） 半許可性細胞既不整合也不裂解（人細胞）,SV40載體類型,取代型重組病毒 去掉晚期區(qū)一段DNA，外源基因可插入 需輔助病毒感染 可形成病毒顆粒 重組病毒-質(zhì)粒載體 保留病毒復制相關序列 插入細菌質(zhì)粒序列，可在大腸桿菌種復制增殖 不形成病毒顆粒,SV40及衍生載體的優(yōu)點,可在多種細胞中表達 基因組DNA、cDNA均可表達 SV40的復制起始點 廣泛宿主范圍的啟動子 多聚A信號 DNA拼接供體和信號（剪接內(nèi)含子） 部分載體含有報告基因,感染宿主范圍有限 復制只能在猿猴細胞中 載體DNA分

13、子量小，容量小 在用輔助病毒混合感染時，有野生化危險,SV40及衍生載體的缺點,痘苗病毒,雙鏈DNA病毒 180kb，編碼200種左右的蛋白 可獨立的在細胞質(zhì)中復制轉錄,痘苗病毒載體優(yōu)越性,宿主范圍廣泛 容量大插入的外源基因可達25kb 瞬時表達 無致癌性本身即需接種 可作為重組活疫苗的載體,痘苗病毒載體的缺點,分子量大，操作較困難 無剪接功能不能插入含內(nèi)含子的基因 外源基因必須插入非必需區(qū),構建重組痘苗病毒流程,tk基因插入質(zhì)粒 tk基因內(nèi)插入痘病毒早期啟動子 接上多克隆位點 接上外源基因 野毒株感染細胞 導入重組載體 同源重組含外源基因的tk基因取代 篩選含外源基因的重組病毒 感染敏感宿主

14、細胞表達外源基因,腺病毒,Ad病毒顆粒的直徑為70-90nm，呈20面體立體對稱型，核心外層的殼體由252個殼粒亞單位組成 雙股線型DNA，DNA約占病毒重量的11-14% 不同亞型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，與其致瘤性能強弱有關 Ad2基因組的早期轉錄區(qū)有6個獨立的區(qū)域: IA(EIA)、EIB、E2(E2A和E2B)、E3、E4 Ad2基因組約長36kb，EIA和EIB與Ad2的啟動和轉化細胞密切有關 腺病毒雖然分布廣泛，其中某些亞型對動物具強致瘤性，但是從A組到E組，迄今尚未證明與人類腫瘤有病因學上的聯(lián)系,腺病毒載體,容量較大：可插入7kb 易培養(yǎng)、純化 復制與轉錄依賴與宿主聚合

15、酶 不整合 釋放殼體蛋白，引起免疫反應,基因的導入方法,光穿孔法：激光；懸浮細胞 沖擊波：活體局部的基因轉移 基因槍法：即微粒轟擊；動物細胞，更適用于植物細胞 穿孔法：脈沖電場；Cytomix緩沖液；70%細胞死亡時效率最高 磷酸鈣共沉淀法 脂質(zhì)體法：Lipofectin；陽離子 抗體轉染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白 其他：超聲波法；微注射法原生質(zhì)體融合法；反轉錄病毒感染法,表達產(chǎn)物的檢測技術,Western印跡法免疫學方法抗原-抗體反應 熒光顯微鏡法表位標記的抗體與直接抗體進行熒光標記免疫學方法,Western印跡法,蛋白樣品制備 SDS-PAGE（按分子量大?。╇娹D移一抗（特異性

16、）二抗顯色 敏感度：1-5ng,樣品的制備,裂解細胞 電泳加樣緩沖液裂解細胞（煮沸5-10min） 抽提細胞蛋白（超聲）,SDS-PAGE,丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)，形成一定孔徑的分離介質(zhì)，孔徑大小由濃度決定，具有分子篩效應 在不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，具有濃縮效應 蛋白質(zhì)本身的電荷效應 SDS：陰離子去污劑，與蛋白質(zhì)結合 SDS濃度大于0.05%時，使樣品中的蛋白質(zhì)帶同樣密度的電荷 電泳時使蛋白遷移只與分子量有關，且呈線性（對數(shù)分子量與遷移率），可測定分子量,電轉移,支持介質(zhì)：重氮芐氧甲基紙（DBP紙）、陰離子化尼龍膜、硝酸纖維素膜（NC） 蛋白質(zhì)帶負電，向正極遷移 凝膠考馬斯亮蘭染色，檢查轉移是否完全 膜麗春紅染色 標記分子量位置,靶蛋白的免疫學檢測,封閉非特異性結合位點，脫脂奶粉或血清白蛋白 第一抗體：具有特異性，最好氏多抗或抗血清 標記的第二抗體：同位素標記；堿性磷酸酶（AKP）標記；辣根過氧化物酶（HRP）標記 注意封閉非特異性位點 注意抗體濃度：尤其是一抗?jié)舛?顯色反應,AKP催化5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸與氮藍四唑發(fā)生反應，產(chǎn)生深藍色 HRP催化3,3-二氨基聯(lián)苯胺與H2O2反應產(chǎn)生棕色條帶，易褪色