1、項目七 蛋白質(zhì)和氨基酸含量的測定,項目內(nèi)容： 一、蛋白質(zhì)含量測定 7.1 乳粉蛋白質(zhì)含量測定（實驗準(zhǔn)備） 7.2 乳粉蛋白質(zhì)含量測定-樣品消化 7.3 乳粉蛋白質(zhì)含量測定-消化液蒸餾及滴定 二、氨基酸含量測定 7.4 氨基酸含量測定,第一部分 課題引入 一、蛋白質(zhì)的重要性 1. 蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)必不可少的重要成分 蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。,蛋白質(zhì)占干重: 人體中（中年人）: 人體 45% 水 55% 細(xì)菌 50%80% 蛋白質(zhì) 19% 真菌 14%52% 脂肪 19% 酵母菌 14%50% 糖類 1% 白地菌 50% 無機(jī)鹽 7%,7.1 蛋白質(zhì)含

2、量測定-實驗準(zhǔn)備,2. 蛋白質(zhì)在生命活動中具有舉足輕重的作用 蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與了 幾乎所有的生命活動過程。 酶抗體血液 肌肉激素表皮、毛發(fā) 3. 蛋白質(zhì)有營養(yǎng)功能，在加工過程中起到重要作用,在食品加工的過程中，蛋白質(zhì)除了表現(xiàn)出營養(yǎng) 方面的重要性，在食品的品質(zhì)、 結(jié)構(gòu)、形態(tài)以及色、香、味 等方面均具有重要作用.,蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。 碳 (C) 50% 氫 (H) 6% 氧 (O) 19%24% 氮 (N) 16% 硫 (S) 0%4% 少量的磷 (P) 、鐵 (Fe) 、 銅 (Cu)、鋅 (Zn) 和碘 (I)等 蛋白質(zhì)含量(%

3、)蛋白質(zhì)含N量 6.25 100%,二、蛋白質(zhì)的組成,蛋白質(zhì)是人體中唯一氮的來源，糖類和脂肪都不能代替,一般樣品含氮量平均在16%,取其倒數(shù)100/16=6.25，即為蛋白質(zhì)換算系數(shù)，其含義是樣品中每存在1g元素氮，就說明含有6.25g 蛋白質(zhì)）,簡單蛋白：分子中僅含有氨基酸； 結(jié)合蛋白（雜蛋白）：由氨基酸和 其他非蛋白物質(zhì)組成。 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是氨基酸,三、氨基酸,1、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類 1）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式 非解離形式 兩性離子形式 與羧基相鄰的-碳原子上都有一個氨基，故稱為-氨基酸 天然存在的氨基酸均為 L-氨基酸（除甘氨酸），各種氨基酸的 R 側(cè)鏈各不相同。,2）氨基酸的分類,中性AA

4、 按R基團(tuán)的酸堿性分 酸性AA 堿性AA,人體所需的八種必需氨基酸 ： 賴氨酸(Lys) 纈氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Trp) 亮氨酸(Leu) 異亮氨酸(Ile) 蘇氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe) 嬰兒時期所需: 組氨酸(His),3）必需氨基酸 在人體內(nèi)不能合成，只能由食物提供的氨基酸。,2、氨基酸的化學(xué)性質(zhì) 1）氨基酸的等電點 當(dāng)溶液濃度為某一pH值時，氨基酸分子中所含的 -NH3+和-COO-數(shù)目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點，簡稱pI。 氨基酸的離解性質(zhì): pHpI pH=pI pHpI 凈電荷 +1 0 -1 正離子 兩性離子 負(fù)離子,氨基酸

5、與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。 加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€碳的醛。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。 NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍(lán)紫色化合物。,2）氨基酸與茚三酮反應(yīng),3）基酸氨基酸與金屬離子的整合作用 許多重金屬離子和氨基酸作用產(chǎn)生螯合物。 4）氨基酸的脫氨基、脫羧基反應(yīng) 脫氨基反應(yīng)與脫羧基反應(yīng)是食品腐敗，產(chǎn)生毒性和臭味的原因。 5）褐變反應(yīng)（美拉德反應(yīng)） 氨基酸和糖在加熱過程中生成類黑色 物質(zhì)的反應(yīng)。 是食品加工中常見的化學(xué)反應(yīng)。 應(yīng)用：賦予食品焙烤香味和色澤。,第二部分 基礎(chǔ)知識,一、測定蛋白質(zhì)含量的常

6、規(guī)方法（5種） 1、凱氏定氮法 2、乙酰丙酮比色法？ 3、雙縮脲比色法等， （這些方法均存在著樣品需要預(yù)處理、操作繁瑣耗時等缺點。但凱氏定氮法和乙酰丙酮比色法作為我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，分析成本低，測定結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)用十分廣泛。） 4、近紅外光譜技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期迅速發(fā)展起來的一項物理測試技術(shù)。近紅外透射或反射光譜具有分析樣品用量少、分析速度快和結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，在食品分析領(lǐng)域已經(jīng)逐步得到了應(yīng)用。 5、杜馬斯燃燒法比凱氏定氮法還早，近年來杜馬斯燃燒法測定飼料、肥料等農(nóng)產(chǎn)品中氮含量在我國也有了應(yīng)用。,二、凱氏定氮法,GB 5009.5-2010 食品中蛋白質(zhì)檢測方法 第一法：凱氏定氮法 第

7、二法：分光光度法 第三法：燃燒值法 凱氏定氮法是1883年Kjeldahl發(fā)明，當(dāng)時凱氏只使用H2SO4來分解試樣，來定量谷物中的蛋白質(zhì)，后來由Gunning加入改進(jìn)，在消化時加入K2SO4使沸點上升，加快分解速度，凱氏定氮法至今仍在使用。 根據(jù)食品中蛋白質(zhì)含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。,凱氏定氮可以分為三種，分別為常量凱氏定氮法和微量、半微量 其區(qū)別： 1. 常量由于可以把全部消化液一同蒸餾測定，故較適合蛋白質(zhì)含量低的樣品。 2.微量、半微量皆取消化液的一部份操作，可平行蒸餾操作，但檢測限要較常量法高。 3.從回收率的角度看，半微量要稍好。,半微

8、量凱氏定氮裝置,微量凱氏定氮裝置,微量、半微量差別在裝置上，二者皆屬于水蒸汽蒸餾操作，只是前者把蒸汽直接導(dǎo)入反應(yīng)室內(nèi)，后者把蒸汽導(dǎo)入反應(yīng)室外加熱。,常量凱氏定氮裝置,1. 原理：食品與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或者鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。其反應(yīng)方程式如下： 蛋白質(zhì)+ H2SO4 （NH4）2SO4 （NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4 NH4OH H2O + NH3 NH4OH NH3+(標(biāo)準(zhǔn)) H2SO4（NH4）2SO4 (標(biāo)準(zhǔn)) H2S

9、O4+NaOHNa2SO4+H2O 凱氏定氮法所測得的含氮量為食品的總氮量，其中還包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游離氨氮、生物堿氮、無機(jī)鹽氮等，由凱氏定氮法測得的蛋白質(zhì)稱為粗蛋白質(zhì)。,2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4,（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用濃硫酸（98%）,除非另有規(guī)定，本方法中所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682 規(guī)定的三級水。 4.1 硫酸銅（CuSO45H2O）。 4.2 硫酸鉀（K2SO4）。 4.3 硫酸（H2SO4 密度為1.84Kg/L）。 4.4 硼酸（H3BO3）。 4.5 甲基紅指示劑（C15H15N3O2）。 4.

10、6 溴甲酚綠指示劑（C21H14Br4O5S）。 4.7 亞甲基藍(lán)指示劑（C16H18ClN3S3H2O）。 4.8 氫氧化鈉（NaOH）。 4.9 95%乙醇（C2H5OH）。,2.試劑和材料,4.10 硼酸溶液（20 g/L）：稱取20 g 硼酸，加水溶解后并稀釋至1000 mL。 4.11 氫氧化鈉溶液（400 g/L）：稱取40 g 氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至100 mL。 4.12 硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.0500 mol/L）或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.0500 mol/L）。 4.13 甲基紅乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1g 甲基紅，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100

11、 mL。 4.14 亞甲基藍(lán)乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1g 亞甲基藍(lán)，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。,試劑和材料,4.15 溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1g 溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。 4.16 混合指示液：2 份甲基紅乙醇溶液（4.13）與1 份亞甲基藍(lán)乙醇溶液（4.14）臨用時混合。也可用1 份甲基紅乙醇溶液（4.13）與5 份溴甲酚綠乙醇溶液（4.15）臨用時混合。,試劑和材料,3.儀器和設(shè)備：如前所述,1）樣品處理 稱取充分混勻的固體試樣0.2 g-2 g、半固體試樣 2 g-5 g 或液體試樣10 g-25 g（約相

12、當(dāng)于30 mg-40 mg 氮），精確至0.001 g，移入干燥的100 mL、250 mL 或500 mL 定氮瓶中，加入0.2 g 硫酸銅、6 g 硫酸鉀及20 mL 濃硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5 h-1 h。 取下放冷，小心加入20 mL 水。放冷后，移入100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。,4.實驗步驟,按圖裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3 處，加

13、入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液（1 g/L）數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰。 向接收瓶內(nèi)加入10.0 mL 硼酸溶液及1-2 滴混合指示液并使冷凝管的下端插入液面下，根據(jù)試樣中氮含量，準(zhǔn)確吸取2.0 mL-10.0 mL試樣處理液由小玻杯注入反應(yīng)室，以10 mL水洗滌小玻杯并使之流入反應(yīng)室內(nèi)，隨后塞緊棒狀玻塞。將10.0 mL 氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。,2）蒸餾,蒸餾10 min 后移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾1 min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外

14、部，取下蒸餾液接收瓶。 以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至終點，其中2 份甲基紅乙醇溶液與1 份亞甲基藍(lán)乙醇溶液指示劑，顏色由紫紅色變成灰色，pH 5.4；1 份甲基紅乙醇溶液與5 份溴甲酚綠乙醇溶液指示劑，顏色由酒紅色變成綠色，pH 5.1。同時作試劑空白。,3）接收、滴定,4）結(jié)果處理,X 試驗中蛋白質(zhì)含量 ，g/100g（舊標(biāo)準(zhǔn)中有g(shù)/100 mL） V1 試樣消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL V2 空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL V3 吸取消化液的體積，單位為毫升（mL） c 硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L m 試樣質(zhì)量，g,0.0140 1.0 mL 硫酸c

15、(1/2H2SO4)1.000 mol/L或鹽酸c (HCl) 1.000 mol/L標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g）； M 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）； F 氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。一般食物為6.25；純?nèi)榕c純?nèi)橹破窞?.38；面粉為5.70；玉米、高粱為6.24；花生為5.46；大米為5.95；大豆及其粗加工制品為5.71；大豆蛋白制品為6.25；肉與肉制品為6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵為5.30；復(fù)合配方食品為6.25。 乳制品中蛋白質(zhì)的含量要結(jié)合具體的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行轉(zhuǎn)換和計算。,結(jié)果表示：以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，蛋白質(zhì)含量

16、1 g/100 g 時，結(jié)果保留三位有效數(shù)字；蛋白質(zhì)含量1 g/100 g 時，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。 精密度：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10 %。,三、凱氏定氮各步驟詳解,整個過程分四步： 1、消化 2、蒸餾 3、吸收與滴定 4、計算,第一步：樣品消化,樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機(jī)物脫水。并破壞有機(jī)物，使有機(jī)物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而蛋白質(zhì)則分解氮，則與硫酸結(jié)合成硫酸銨，留在酸性溶液中。 下面注意幾種試劑的作用：,硫酸鉀的作用 添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點33

17、0，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá)400，加速了整個反應(yīng)過程。 硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會分解，放出氨而造成損失。,濃硫酸的作用:,1、脫水使有機(jī)物炭化，然后有機(jī)物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2，本身則變?yōu)镃O2 2、氧化 3、蛋白質(zhì)與濃H2SO4生成NH3，CO2，SO2，H2O 4、與NH3生成硫酸銨,其他試劑的作用,硫酸銅，氧化汞或硒粉，催化劑，加快反應(yīng)速度（但為了防止污染通常使用硫酸銅，所以有機(jī)物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，還可以作為堿性反應(yīng)指示劑）。 有的加少量過氧化氫、次氯酸鉀作為氧化劑。 50%NaOH的作用 蒸餾時使溶液呈堿性,第二步蒸餾：,樣

18、液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中。 一是加入氫氧化鈉溶液要過量，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強(qiáng)酸，使顏色變紅。 二是要防止樣液中氨氣逸出。,第三步吸收與滴定：,蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行氨的吸收，然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。（全量） 半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用。（用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強(qiáng)酸，要求較嚴(yán)，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在

19、3%以上可將氨完全吸收，為保險起見一般用4%）。,1. 用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑）國標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅。 指示劑 紅色 綠色 紅色 （酸） （堿） （酸） 2. 用過量的 H2SO4 或 HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用 NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。,吸收,滴定,蒸餾終點的判斷,1.以奈氏試劑Nessler試劑，K2（HgI4）檢驗NH4+離子，遇銨根，離子析出黃色或紅棕色沉淀。 配制方法1： 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時過濾

20、，并存于玻璃瓶中蓋緊口。 方法2： 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于適量少許水，后加水稀釋至50 ml,靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲存于棕色瓶中。,結(jié)果計算：如前所述 注意事項： 所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。 消化時不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。 消化時應(yīng)注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，并促進(jìn)其消化完全。 樣品中若含脂肪較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應(yīng)用小火加熱，并時時搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控

21、制熱源強(qiáng)度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30過氧化氫 23 m1 后再繼續(xù)加熱消化。, 若取樣量較大，如干試樣超過5 g 可按每克試樣5 m1的比例增加硫酸用量。 般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當(dāng)延長消化時間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。 蒸餾裝置不能漏氣。 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在7090時發(fā)黑。 蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源否則可

22、能造成吸收液倒吸。,第三部分 工作任務(wù),任務(wù)1：乳粉蛋白含量的測定實驗設(shè)計（填寫工作任務(wù)單） 各組看書，討論，制定整個任務(wù)的工作計劃。 內(nèi)容包括：實驗步驟、儀器、試劑以及所需溶液的配制。 時間：20分鐘 工作任務(wù)2：凱氏燒瓶的清洗及模擬消化操作（10分鐘） 工作任務(wù)3：鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)定方案制定。（20分鐘）,第四部分 任務(wù)評價,任務(wù)一：各組都要交上來打分 任務(wù)二：選1-2組進(jìn)行展示 任務(wù)三：各組上交方案打分,第五部分 拓展知識,一、其他蛋白質(zhì)含量測定方法 1. 分光光度法（第二法） 原理： 食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在pH 4.8 的乙酸鈉-

23、乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。 在波長400 nm 下測定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。 換算系數(shù)與第一法相同。,2. 燃燒法（第三法）,原理： 試樣在900 -1200 高溫下燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，其中的碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮氣，形成的氮氣氣流通過熱導(dǎo)檢測儀（TCD）進(jìn)行檢測。 檢出限：第一法當(dāng)稱樣量為5.0 g 時，定量檢出限為8 mg/ 100 g。 第二法當(dāng)稱樣量為5.0 g 時，定量檢出限為0.1 mg/100 g。,二、微量凱氏定氮法

24、,1、原理及適用范圍同前 2、與常量法不同點： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸餾裝置見 159 頁圖 10-2 。,10-2,10-2,三、自動凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、特點： （1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。 （2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。 （3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗?，12分鐘完成1個樣。,三、雙縮脲法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費時間，有環(huán)

25、境污染。 新開發(fā)的： 雙縮脲法、 紫外分光光度法、 染料結(jié)合法、 水楊酸比色法等。,1.原理 脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時，兩分子縮和成雙縮脲。,雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)） 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵 CONH 與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量。（560nm）,NH2CONHCONH2 + NH3,注：測蛋白質(zhì)時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化 2.方法特點及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含

26、量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。 3.主要儀器： 分光光度計，離心機(jī)（4000 r/min） 4.試劑： (1)堿性硫酸銅溶液 (2)四氯化碳,5操作方法：采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。 四紫外吸收法 1原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，,對紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。,2適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因為干擾因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。 3主要儀器： 紫外分光光度計 離心機(jī)（3000 5000 r/min） 4操作：用凱氏法測定作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線,7.2 乳粉蛋白質(zhì)含量測定2（樣品消化）,第一部

27、分 任務(wù)布置 任務(wù)一 根據(jù)方案，完成樣品的消化操作。 任務(wù)二 根據(jù)方案進(jìn)行鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置與標(biāo)定。每組配制100ml自用。,第二部分 任務(wù)介紹,樣品消化過程 稱取充分混勻的固體試樣0.2 g-2 g、半固體試樣 2 g-5 g 或液體試樣10 g-25 g（約相當(dāng)于30 mg-40 mg 氮），精確至0.001 g，移入干燥的100 mL、250 mL 或500 mL 定氮瓶中，加入0.2 g 硫酸銅、6 g 硫酸鉀及20 mL 濃硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色并澄清透

28、明后，再繼續(xù)加熱0.5 h-1 h。 取下放冷，小心加入20 mL 水。放冷后，移入100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。,標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制,各組根據(jù)上節(jié)課制定的方案進(jìn)行配制與標(biāo)定，容量瓶上寫明班級、組別、日期以及標(biāo)定后的濃度，下周使用。,第三部 消化操作,1、消化瓶瓶口不要指向人群； 2、控制加熱速度，一定緩慢加熱，防止爆沸溢出； 3、加水操作一定要緩慢，并不斷攪拌； 4、消化液定容后要寫明班級、組別及日期。,第四部分 歸納總結(jié)及評價 各自自行歸納實驗得失，進(jìn)行小組內(nèi)自評，寫入到任務(wù)單上。,7.3 乳粉蛋白質(zhì)含量測定3（蒸餾滴

29、定）,第一部分 任務(wù)引入 消化液的蒸餾、吸收與滴定、計算。 第二部分 任務(wù)介紹 1、蒸餾、吸收 步驟如前所述，注意事項： 嚴(yán)格控制加熱速度，氫氧化鈉加入 過程要快速。,2、溶劑的配制 硼酸溶液（20 g/L）：稱取20 g 硼酸，加水溶解后并稀釋至1000 mL。1組配制，共計1L 氫氧化鈉溶液（400 g/L）：稱取40g 氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至100mL。2、3、4組，每組配制100ml。共計300ml。 甲基紅乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1g 甲基紅，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。5組配制 亞甲基藍(lán)乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1g 亞甲基藍(lán)，溶于95

30、%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。6組配制 溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1g溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。7組配制 混合指示劑：分裝至4個干凈的帶膠頭滴管的棕色試劑瓶中，8組配制。 標(biāo)簽上注明班級、組別以及試劑名稱和濃度。,3、滴定操作 按方案進(jìn)行。 4、計算 第三部分 操作 第四部分 總結(jié)評價 組內(nèi)自評，完成任務(wù)單,第五節(jié) 氨基酸的定性測定,利用各種顯色反應(yīng)（170174頁）。,第六節(jié) 氨基酸定量測定一氨基酸的一般定量測定（一）甲醛滴定法,1.原理：氨基酸本身有堿性 NH2 基，又有 酸性 COOH 基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛 溶液后，與 NH2

31、結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定 COOH 基。 2特點：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。（適于食品中游離氨基酸的測定）,3雙指示劑： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用 氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍(lán)色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液， 0.1%中性紅50%乙醇溶液， 0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。 4操作：同時取兩份樣： + 中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和 樣液中其它酸性物質(zhì)。 + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總 和。 二者之差可計算氨基酸含量,（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定條件下與茚

32、三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，可比色定量。 二個別氨基酸的定量測定 介紹了8種氨基酸的定量測定方法。,第七節(jié) 氨基酸的分離與測定 一薄層色譜法（薄層層析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 簡介： 近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因為層析在薄層上進(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。,（一）原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以大致確定其含量。,Rf = a / b,a,b,樣點,溶劑前沿,點樣原點,優(yōu)點： 展開時間短，一般在2030分鐘，展開距離通常只需10 cm，且分離效果好。 層析后得到的斑點小而清晰。 能夠使用多種顯色劑。 點樣量少，靈敏度高。（比紙層析高101